魔芋寡糖的膜分离及产物组成分析

唐湘华,杨云娟,顾天坤,慕跃林,吴 倩,黄遵锡,*

(1.云南师范大学生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,云南昆明 650500;2.云南省酶工程技术研究中心,云南昆明 650500;3.云南师范大学生命科学学院,云南昆明 650500)

魔芋是天南星科魔芋属中具有球茎的多年生草本植物,广泛分布在中国的云南、贵州、四川、湖北、安徽、河南等地[1-2]。魔芋中含有大量的葡甘露聚糖[3-4],为天然高分子化合物,具有较好的黏性,能与水结合成胶体溶液[5-6],可用于食品稳定剂[7-8]、增稠剂[9]、胶凝剂[10-11],益生菌的包埋剂[12-13]等。魔芋寡糖是一类由2～20个单糖聚合而成的聚糖混合物[14-15],是从魔芋原料中提取的产物。魔芋寡糖的制备通常采用酸法、酶法或者微波法获得[16-18]。酶法水解是反应比较温和的常用方法,采用β-甘露聚糖酶水解低浓度魔芋粉进行制备,而高溶质浓度魔芋粉水解能提高生产效率,降低生产成本,能获得高收率的寡糖,但高浓度魔芋精粉进行酶法水解会导致溶液中出现高浓度粗纤维、溶液粘度大,形成高浓度浑浊悬浮液,不利于后处理。因此,如何快速、高效的从水解液中分离获得寡糖产品,一直是当前工艺分离的热点,而采用梯度逐级分离寡糖形成单一产品是将来发展的核心。

膜过滤是现代用于分离、浓缩的一类新型的生物技术,如白酒过滤除杂、去除异味[19]、酱油调味液的过滤[20]、谷氨酸[21]的过滤、多糖的分离与纯化[22]、药物的分离[23]、食品饮料行业[24-25]等都有所应用,其使用范围遍及各个行业。由于膜过滤的能耗低,效率快,目前已被广泛应用于各个行业。魔芋寡糖是一类具有黏性、浓度高的小分子聚糖,其分子量在342～3300 Da之间,要进行分离常采用离子交换法[26]、凝胶过滤分离[27],但工业化程度低;膜过滤[28]是一类能耗低、损失小、温和型的分离方法,适合用于工业化生产。多级膜过滤串联能实现逐级过滤分离,可用于黏度低、溶质物低的生物活性物质溶液的分离,但用于魔芋寡糖分离的研究报道较少。本研究采用高速离心机,结合微孔陶瓷膜、超滤膜和超滤膜的组合,探索在高浓度魔芋水解产物的分离、纯化、浓缩的应用,为功能糖的开发应用提供可行性依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

魔芋精粉(85%纯度的一级粉) 丽江玉元食品有限公司提供;酸性甘露聚糖酶(20000 U/g) 昆明爱科特生物科技有限公司生产。

定制型200L不锈钢酶解罐 云南宝泰轻化机械有限公司;WDR0.06-0.7全自动小型电加热蒸汽锅炉 上海华征特重锅炉制造有限公司;8WDH-604高速离心分离机 南京绿岛机械设备有限公司;SJM-MF-3.4无机陶瓷膜过滤设备 合肥世杰膜工程有限责任公司;4040型超滤、纳滤实验一体机(有机超滤膜分子量5000 Da,有效膜面积7 m2,有机纳滤膜分子量100 Da,有效膜面积37 m2) 江苏无锡伟尔生化设备厂;TGL-16B高速离心机 上海安亭科学仪器厂;UV-5100紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;WAY-2w阿贝折光仪 上海光学仪器厂;NDJ-5S数显黏度计 上海平轩科学仪器有限公司;CJJ-931四联磁力加热搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 魔芋寡糖的水解制备 图1为魔芋寡糖水解制备工艺,在酶解罐a中加入100 kg纯净水,加热到60 ℃,添加内切型β-甘露聚酶使水溶液中的酶活力为50 U/mL。称取12.5 kg一级魔芋精粉b,缓慢加入到酶解罐中(10 min内完成),边水解边混合,形成的水解溶液低于100 cP;然后继续加入12.5 kg魔芋精粉(10 min内完成),该阶段由于起始酶蛋白浓度高,酶解速度快,水解液中的黏度都很低,随着溶质增多,单位酶蛋白催化水解的葡甘露聚糖变多形成过饱和状态,需要不断搅拌混合酶解1 h,使溶液黏度降低到50 cP时结束酶解过程;间接升温使酶解罐中的水解液温度达到80 ℃,保温10 min终止酶解反应,再通入冷却水使溶液冷却到45 ℃,利用酶解罐底部的初级筛网对反应体系中的粗纤维进行过滤截留,获得粗滤液c;使用转数8000 r/min的碟片式离心机分离去除初级过滤液c中的淀粉、小分子纤维、悬浮物,获得离心过滤液d;再把离心过滤液d经过0.2 μm孔径的无机陶瓷膜组件进行微孔过滤,去除废渣、蛋白及大分子多聚糖,获得陶瓷膜过滤液e;陶瓷膜过滤液e通过超滤膜组件后得超滤透过液f,超滤透过液f再经过纳滤膜过滤得到纳滤浓缩液g,经喷雾干燥后获得粉剂产品h。

图1 魔芋寡糖制备工艺流程图

1.2.2 酶法水解液黏度变化分析 当魔芋精粉加入到酶解罐中进行酶法水解,每隔5 min取水解液样品500 mL,使用转子黏度计测定黏度。

1.2.3 高浓度魔芋水解液对膜过滤通量的影响

1.2.3.1 陶瓷膜过滤 用转数8000 r/min的碟片式离心机分离去除粗滤液c中的淀粉、粗纤维,获得离心液d,再把离心液经过0.2 μm孔径的无机陶瓷膜组件(操作压力为0.3 MPa,循环溶液的温度上限控制在50 ℃),通过不断循环使浓缩液的透过液糖度低于10 g/L时,结束操作,收集透过膜的溶液即为陶瓷膜过滤液e。

1.2.3.2 超滤膜过滤通量测定 实验收集了寡糖浓度为150 g/L的微孔透过液e进行超滤膜的过滤通量测试,分析膜过滤技术对粘性寡糖溶液分离的可行性,选用的超滤膜组件能对分子量大于5000 Da的聚糖大分子、蛋白和生物碱等物质进行截留筛分。实验操作过程中,泵的工作压力为0.3 MPa,溶液的温度上限控制在50 ℃,每隔5 min测定透过液的重量和溶液中的寡糖含量,计算超滤膜的过滤通量、寡糖浓度和寡糖回收率。

1.2.3.3 纳滤膜过滤通量测定 把洗超滤膜的透过滤液和超滤透过液f进行收集后得到112 g/L的寡糖溶液,作为纳滤膜过滤的初始浓度进行测试纳滤膜的通透性和浓缩效应。在纳滤膜操作压力为1.3 MPa,溶液温度控制在50 ℃以下的条件下进行浓缩过滤,每隔5 min测定透过液m废水的重量和废水中还原糖，计算纳滤膜过滤通量;同时测定浓缩液e中的寡糖浓度。

1.2.4 指标的测定

1.2.4.1 魔芋寡糖的测定 分别取超滤液f 和纳滤浓缩液e 0.2 mL滴在阿贝折射仪样品仓中,测定超滤液f和纳滤浓缩液e溶液中的总糖含量;再分别稀释超滤液f和纳滤浓缩液e样品25倍,分别取2 mL稀释液到试管中,向试管中加入3 mL入DNS试剂,混合,沸水浴5 min,冷却,每支试管加入10 mL单蒸水,混合均匀,在波长540 nm处,比色测定OD,通过下面公式计算还原糖含量。

式中:0.894表示甘露糖标准曲线的斜率;0.017为标准曲线的截距;25表示溶液的稀释倍数;0.2表示取样量,mL。

魔芋寡糖含量=总糖含量-还原糖含量

1.2.4.2 膜过滤通量的测定

式中:J表示寡糖溶液的过滤通量,kg/h·m-2;m表示膜透过液的重量,kg;t表示过滤时间,h;S表示过滤膜的面积,m2。

1.2.4.3 寡糖的回收率测定

魔芋寡糖的回收率η(%)=(浓缩液中的寡糖浓度×过滤后溶液总体积)/过滤时溶液中的寡糖含量×总体积×100

1.2.4.4 魔芋寡糖组成成分的MALDI-TOF-MS分析 对魔芋寡糖的浓缩液样品稀释到5倍,使溶液中的寡糖浓度为40 g/L,取样品和2,5-二羟基苯甲酸(DHB)基体溶液按照1∶1稀释后混合在MALDI板上,室温干燥,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF进行分析寡糖的组成。仪器使用MALDI离子化,每个质谱共获得10000～20000次激光发射,质谱采用阳离子模式下的超光谱MALDI-TOF/TOF Bruker质谱仪采集。

1.3 数据处理

使用Excel 2010对测定值进行计算,使用Origin 8.5软件对数据进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 酶法水解高浓度魔芋粉的制备液黏度变化分析

图2为β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉的水解液黏度变化曲线图,实验过程分两次添加魔芋粉,最终溶液中的魔芋粉浓度为250 g/L (w/v)。当12.5 kg魔芋精粉第一次加入到50 U/mL的酶溶液中,形成的浓度为125 g/L,酶蛋白的催化水解效应极大的降低了魔芋精粉的吸水系数,导致酶解液的黏度较低,维持在100 cP;当第二次添加魔芋粉,导致水解液的黏度快速升高到1000 cP,随着酶解反应时间的延长,寡糖制备液中的黏度在90 min时降到50 cP左右,溶液的流动性较好,有利于管道的输送。

图2 250 g/L的魔芋粉水解液的黏度变化曲线

2.2 魔芋寡糖的分离

2.2.1 魔芋寡糖对超滤膜过滤的影响 魔芋寡糖是一类小分子聚糖的混合物,包含2～20个糖环的聚合体,分子量在342～3300 Da内[27]。采用酶法水解高浓度魔芋精粉,通过控制酶解液的黏度和聚合度,定向控制葡甘露聚糖的水解程度,制备不同组合的魔芋寡糖。由于实验使用了高浓度水解工艺,魔芋精粉没有被充分水解,大分子聚糖和魔芋中的纤维导致水解液黏度高,膜的表面阻力大,过滤通量降低。图3为超滤膜过滤魔芋粉水解液的通量和回收率的变化情况,在溶剂以水为参比的条件下,超滤膜的过滤通量为25.2 kg/h·m-2,而在含有150 g/L浓度的寡糖的初始过滤通量为7.02 kg/h·m-2,90 min后,过滤通量只有4.45 kg/h·m-2,过滤效率相比于初始时下降了37%;通过对比溶剂的过滤通量发现,透过液中的寡糖浓度随时间的延长而增加,而超滤膜的过滤通量在降低,表明水解糖溶液中的溶质严重影响着超滤膜的过滤通。寡糖浓度随着过滤时间的延长在不断的增高,表明聚合度低的寡糖和溶剂水优先进入透过液,聚合度高的寡糖分子排在后面,导致前期寡糖浓度低,后期浓度增高;而寡糖回收率η也随着透过液的增多而增加,当过滤时间为90 min时,寡糖的回收率η达到86.7%,表明利用超滤膜处理寡糖的工艺路线是可行的。

图3 寡糖对超滤膜过滤通量和回收率的影响

2.2.2 寡糖对纳滤浓缩的影响 图4分析了纳滤膜的浓缩效应,由于选用的纳滤膜截留分子量较小,大量的溶剂水、有机酸、小分子的物质和金属离子被带走,寡糖分子被截留下来,溶液中寡糖浓度被不断提高,通过超滤和纳滤的分子筛效应形成高浓度的寡糖溶液,能达到187 g/L浓度。从纳滤通量的曲线图可以看出,以水为过滤介质的通量能达到6.45 kg/h·m-2,而在寡糖浓缩废液过滤通量的测试中,随着溶质浓度增高,纳滤的初始过滤通量由2.51降到0.6 kg/h·m-2,表明寡糖浓度越高,纳滤的过滤通量越低。考虑纳滤膜的渗漏现象,在对废水的测定中发现没有还原糖的存在,表明该浓缩技术路线是可行的。

图4 寡糖对纳滤膜过滤通量的影响

2.3 魔芋寡糖成分分析

为了解寡糖的构成比例关系,利用MALDI-TOF-MS进行分析,在图5A中可以看出,从魔芋寡糖的一级质谱图中的碎片峰推断可以看出甘露糖的二聚体到二十聚体都能被检测到,每个糖分子离子碎片峰的差值显示了每个聚糖分子之间相差分子量为162或者162的倍数,而162为单糖脱水形成糖苷的分子量。图谱中的碎片峰对应的分子量为[M+K]+,对应峰的相应糖分子已标注在图,膜分离的产品能检测到二十糖。根据峰面积的比例关系,对寡糖的组成进行了计算,如图5B所示,寡糖产物中以三糖比例较高,达到了21.5%,二糖～十四糖的占比为90%,十五糖～二十糖的比例为9%。

图5 魔芋寡糖的MALDI-TOF-MS分析

3 结论

本文通过膜技术进行寡糖的分离、纯化、浓缩,膜的过滤通量及产品组成的分析。结果表明:采用膜过滤技术用于魔芋寡糖分离、提纯和浓缩工艺是可行的。使用浓度150 g/L的寡糖溶液通过超滤膜过滤,溶质浓度低的溶液过滤通量大,但随着过滤时间的延长,通量出现降低;过滤通量能维持在7.02～4.45 kg/h·m-2,寡糖回收率在90 min时能达到86%以上。纳滤膜过滤通量随着可溶性聚糖的浓度的增加而降低,溶质浓度越低过滤通量越大。通过对100～5000 Da的魔芋寡糖混合物进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析,结果表明寡糖的构成比例中以三糖为主,含量为21.5%。二糖～十四糖的总含量达到90%,十五糖～二十糖的含量为9%。

在超滤提纯工艺中,为了避免因糖浓度过高而出现溶液的通量迅速下降的现象,应对寡糖液进行初步预处理,采用陶瓷膜微孔洗滤、高速离心过滤去除大部分纤维杂质和较大分子量多糖,增加过滤效率。寡糖溶液在超滤过程中产生较大阻力,但流体特性比较好,过滤通量随溶质浓度而发生变化,溶质浓度高,浓差极化现象严重,过滤通量小;在浓度低的寡糖溶液,浓差极化弱,过滤通量快,因此在高浓度水解产物中适当进行稀释,能加速超滤的回收率。

纳滤膜能承受较高压力,通过提高操作压力能加速溶剂水的过滤,提高浓缩液中寡糖的含量。提高操作压力中将会对纳滤的错流操作模式变为常规挤压模式,容易导致膜表面形成的溶质层较厚,大量的寡糖存储在膜的表面,后期需要加水冲洗纳滤膜表面,以获得高的产品回收率。

直接采用魔芋粉进行酶法水解的溶液中,由于糖苷水解酶的专一性,形成的产物种类单一,产物为六碳糖的聚体混合物,通过膜过滤处理后对膜的污染程度进行常规的碱洗后发现,该滤膜能保持正常的过滤通量,糖类物质对滤膜的污染程度较低,使用滤膜过滤魔芋寡糖是完全可行的。