野山杏果肉不溶性膳食纤维对小鼠肠道功能及肠道菌群的影响

彭禛菲,阿依姑丽·艾合麦提,王妙颖,海 雯

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

野山杏属蔷薇科(Rosaceae)落叶乔木,在我国资源丰富[1],集中分布在伊犁、哈密,是重点保护野生植物[2-3],种植面积有扩大趋势[4]。近年来,人们对野山杏资源利用主要集中在杏核上,如提取杏仁油、蛋白质等成分,而果肉往往被丢弃,大大降低其利用价值。

野山杏果肉中含有大量膳食纤维(dietary fiber,DF)[5],研究发现膳食纤维具有预防肥胖、润肠通便、预防结肠癌、调节肠道菌群、调节血糖水平、预防糖尿病等功能[6-7]。水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fibre,IDF)是膳食纤维的一部分,包括纤维素、木质素和大部分的半纤维素等,是果蔬类食物中的主要成分[8],主要有促进肠道机械蠕动,增加粪便体积,预防便秘、肠癌等代谢综合性疾病的功能[9-14]。目前,大量研究集中探讨IDF在肠道中的主要作用,即增加粪便重量、预防便秘[15-17],关于野山杏果肉不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber from wild apricot,IDFWA)对小鼠肠道功能及肠道菌群的影响相关研究较少。

本研究通过动物实验,考察了IDFWA对小鼠小肠推进率、首粒排便时间、首粒排蓝便时间、6 h排粪便总质量及肠道菌群的影响,以期进一步探明IDFWA对小鼠肠道功能与肠道菌群的影响,这对充分利用新疆丰富的野山杏资源,开发高附加值的野山杏相关成分保健食品有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

KM小鼠140只 (20±2) g,雌雄各半,新疆医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK(新)2018-0003,适应1周,自由饮食;野山杏果肉 新疆哈密地区伊吾县苇子峡乡;依文思蓝 上海如吉生物科技发展有限公司;复方地芬诺酯片(每片含盐酸地芬诺酯2.5mg) 长春长红制药有限公司;冰乙酸、乙酸钠 天津市致远化学试剂有限公司;伊红美蓝培养基、乳酸杆菌选择性琼脂、双歧杆菌BS培养基、纤维素酶 Solarbio;蛋白胨、琼脂粉 北京奥博星生物技术有限责任公司;羟甲基纤维素钠 上海山浦化工有限公司。

RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;HH-S型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗器厂;DNP-9052A型电热恒温培养箱 上海冠戈实业有限公司;PHS-3C pH 计上海仪器科学仪器股份有限公司;BSA124S型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;TOMY SX-500高压灭菌锅 Kagoshima Seisakusyo Inc;THZ-82A气浴恒温振荡器 江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 IDFWA的提取 将野山杏果肉切碎,于60 ℃干燥箱内干燥24 h,粉碎,过40目筛,与5.4%醋酸缓冲盐溶液(pH4.8)1∶15 (w/V)混合,加6%的纤维素酶,50 ℃下酶解4 h后,80 ℃灭酶10 min,过滤,所得滤渣于60 ℃干燥后,即为IDFWA。

1.2.2 IDFWA性能的测定 持水性与溶胀性的测定方法参照刘昱迪等[18]。

持水性(WHC)=(样品吸水后的质量(g)-样品干质量(g))/样品干质量(g)

式(1)

溶胀性(SW)=(溶胀后纤维体积V2(mL)-溶胀前体积V1(mL))/样品干质量(g)

式(2)

1.2.3 动物分组及小肠推进实验 参考牛广财等[19]的方法,略有改动。将50只KM小鼠随机分成5组,每组10只,雌雄各半,分别为空白对照组、模型对照组(即复方地芬诺酯组)、IDFWA低剂量组(0.6 mg/(g·d))、中剂量组(1.2 mg/(g·d))、高剂量组(2.4 mg/(g·d))。空白对照组及模型对照组灌服蒸馏水,低、中、高IDFWA处理组灌服相应剂量的IDFWA,连续给药14 d后,各组小鼠禁食不禁水12 h,除空白对照组外,模型对照组与IDFWA处理组灌服复方地芬诺酯 0.05 mg/g,进行造模;30 min 后,各组灌服0.4%的伊文思蓝(2 mg/g)。20 min后颈椎脱臼处死小鼠,打开腹腔,取上自幽门,下至回盲部的肠管,将肠管轻轻拉成直,测量的长度为小肠总长度,从幽门至伊文思蓝推进前沿长度,计算小鼠小肠伊文思蓝推进率[20]。

伊文思蓝推进率(%)=伊文思蓝推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100

式(3)

1.2.4 小鼠排便实验 按1.2.3中分组并给药,从给予伊文思蓝开始计时,单笼饲养每只小鼠,让其自由饮食,观察并记录首粒排便时间、首粒排蓝便时间及6 h排粪便总质量。

1.2.5 IDFWA对小鼠肠道菌群影响

1.2.5.1 动物分组 参考白冰瑶等[21]的动物分组方法,略有改动。将40只KM小鼠机分成4组,每组10只,雌雄各半,分别为空白组与IDFWA低剂量组(0.6 mg/(g·d))、中剂量组(1.2 mg/(g·d))、高剂量组(2.4 mg/(g·d)),除空白组灌服蒸馏水外,3组受试组灌服相应剂量IDFWA,连续灌胃14 d,期间自由饮水与进食标准饲料。

1.2.5.2 粪便的采集 在无菌条件下采取逼迫法、按摩腹部法收集小鼠新鲜粪便0.05 g于无菌EP管,无菌生理盐水定容至5 mL,于漩涡振荡器上充分振荡,使粪便均质化,-20 ℃冻藏,备用[22]。

1.2.5.3 菌落计数 参考白冰瑶等[21]的方法,略有改动。取0.5 mL上述粪便菌液,进行稀释,选择合适梯度的100 μL稀释液分别涂布于相应的选择性培养基上,37 ℃培养。大肠杆菌(伊红美蓝培养基)和金黄色葡萄球菌(BP培养基)培养24 h;乳酸杆菌(乳酸杆菌选择性琼脂)培养48 h;双歧杆菌(双歧杆菌BS培养基)于厌氧带中,培养48 h。

1.2.5.4 菌落鉴定、计数方法 培养后,以菌落形态、革兰氏染色镜检确定目的菌:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,排列是葡萄球状,无芽胞,无荚膜,致病性葡萄球菌菌体较小,平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1～2 mm,其他3种菌参考乐碧云[23]的方法,结果以lgN表示,按以下公式计算:

每克粪便中菌落总数=lg(菌落数×稀释倍数×10)

式(4)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 野山杏果肉不溶性膳食纤维的持水性、膨胀性

不溶性膳食纤维的溶胀性和持水力赋予不溶性膳食纤维特殊的生理功能和保健功能[24]。本实验测得IDFWA的持水性和膨胀性分别为6.11 g/g、4.40 mL/g,较刘昱迪等[18]测的金针菇子实体不溶性膳食纤维持水性(3.749 g/g)和溶胀性(4.026 mL/g)高,说明IDFWA比金针菇子实体IDF有更好的持水性与溶胀性。

2.2 小肠推进作用变化

由表1可知,与空白对照组比较,模型对照组及IDFWA各剂量组小鼠小肠的总长度没有显著性差异(P>0.05);与空白对照组比较,模型对照组伊文思蓝推进长度和推进率极显著降低(P<0.01),说明便秘模型造模成功。与模型对照组相比,低剂量组伊文思蓝推进长度和推进率显著增加(P<0.05),粪便推进率增加20.46%,IDFWA中、高剂量组伊文思蓝推进长度和推进率极显著增加(P<0.01),粪便推进率分别增加26.15%和29.04%。以上结果表明,IDFWA具有促进小鼠小肠蠕动、改善便秘的作用。

表1 IDFWA对小鼠小肠推进作用的影响

2.3 粪便质量的测定

由表2可知,与空白对照组比较,模型对照组首粒排便时间、首粒排蓝便时间、6 h排便总质量差异极显著(P<0.01),说明便秘模型造模成功。与模型对照组比较,IDFWA低剂量组首粒排便时间显著缩短(P<0.05),中、高剂量组极显著缩短(P<0.01);IDFWA各剂量组首粒排蓝时间均极显著缩短(P<0.01);中剂量组6 h排便总质量显著增加(P<0.05),高剂量组极显著增加(P<0.01)。IDFWA具有明显促进便秘小鼠首粒排便时间、首粒排蓝便时间、6 h排便总质量的作用,且促进便秘小鼠首粒排便时间与6 h排便总质量与IDFWA的剂量有关,随着IDFWA剂量的增加,促进便秘小鼠首粒排便时间、6 h排便总质量的作用增强。

表2 IDFWA对小鼠首粒排便时间、首粒排蓝便时间和6 h排便总质量的影响

2.4 肠道菌群数量的测定

如表3所示,与空白对照组相比,IDFWA低剂量组中大肠杆菌数量极显著降低(P<0.01),降低了13.53%,中、高剂量组中大肠杆菌数量有所降低,但差异不显著(P>0.05),说明IDFWA对体内大肠杆菌有一定的抑制作用,低剂量组抑制作用最好;各剂量组中金黄色葡萄球菌数量均有所降低,但不具有统计学意义(P>0.05)。

表3 IDFWA对小鼠肠道菌群的影响(lg CFU/g)

与空白对照组比较,中、高剂量组小鼠粪便中乳酸杆菌数量分别显著增加了8.92%和7.79%(P<0.05),各剂量组的双歧杆菌数量均极显著增加(P<0.01),分别增加了12.23%、14.04%和13.78%,说明IDFWA有促进乳酸杆菌和双歧杆菌生长的作用。

3 讨论与结论

IDFWA的持水性和膨胀性分别为6.11 g/g、4.40 mL/g,有较好的持水性与溶胀性。膳食纤维由于高持水力和较大的膨胀性能,在肠胃道中更容易吸水膨胀形成大体积、高黏度的溶胶或凝胶,产生饱腹感而抑制进食量,同时刺激肠道蠕动,吸附肠道的油脂,从而达到减肥、通便等作用[25]。

IDFWA能明显提高小鼠小肠推进率、降低首粒排便时间、降低首粒排蓝便时间和增加小鼠6 h排便总质量,表明具有良好的润肠通便的作用,其中对小鼠小肠推进率、小鼠6 h排便总质量的影响存在量效关系。长期便秘可诱发相关机体细胞癌变[26]。便秘的形成主要与肠道蠕动不足、肠道益生菌数量下降等有关,如能提高肠道内容物的持水能力和膨胀性、促进肠道蠕动或增加肠道益生菌数量的物质,均能起到改善便秘的效果[27]。

DF在肠道内酵解产生的短链脂肪酸能够降低肠道内的pH,低pH环境能够在一定程度上抑制大肠杆菌的增殖[30],从而减少有害菌的生长,乳酸杆菌与双歧杆菌为肠道中的益生菌,益生菌能够明显改变肠道中的内环境,改善便秘。IDFWA能抑制肠道大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的生长,促进乳酸杆菌与双歧杆菌生长。该结果表明IDFWA能够抑制肠道中有害菌的生长,促进益生菌的生长,该作用进一步提示IDFWA通过改善肠道内环境,从而改善便秘。

IDFWA通过其良好持水性和膨胀能力、促进肠道的蠕动以及增加肠道的益生菌的作用,呈现对肠道的内环境具有很好的改善效果,达到润肠通便改善便秘的功效。