超声波辅助提取刺梨籽黄酮工艺优化及其体外抗氧化活性研究

李美东，罗 凯，黄秀芳

(湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

刺梨(Rosaroxbunghii)属于蔷薇科的植物，在中国具有十分广泛的分布，一直以来作为一种野生水果而受人们的喜爱，拥有维生素C之王的美誉，近年来由于其有极好的药用价值和食用保健价值而被广泛研究和开发利用[1-11].文献报道刺梨中的超氧化物歧化酶(SOD)具有一定的解毒功能、镇静功能[12-14]，刺梨中的黄酮物质具有抗氧化作用，并对动脉粥样硬化[15-16]、糖尿病的防治[17]具有一定的效果.刺梨中的多糖具有一定的抗疲劳效果[18].将刺梨榨成刺梨汁后，汁中的活性成分有更多的功效，例如延缓衰老[19]、对急性胃黏膜的损伤[20]、降低体内重金属的含量[21-23]等.

目前对于刺梨的加工主要运用其果肉，在刺梨加工过程中，刺梨籽等下脚料作为废料而被遗弃，在生产过程中，如能将这些资源进行收集并对其加以有效利用，能够有效的提高刺梨的综合利用并实现良好的经济价值.本文以野生刺梨的种子(刺梨籽)为原料，研究的重点为刺梨籽中黄酮的提取工艺，同时对刺梨籽黄酮的抗氧化性进行相应的探究，为恩施野生刺梨籽的开发与利用提供试验数据以及相应的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生刺梨籽：采摘于湖北省恩施市的野生刺梨.刺梨采摘后去除果肉部分，分离获得野生刺梨的种子，置于50 ℃恒温干燥箱中烘干、粉碎、过100目筛后保存、备用.

芦丁标准品；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(0.1 mol/L)；乙醇(v/v)；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])；甲醇；硫酸铁(500 μmol/L)；4%氢氧化钠；0.1% FeCl3；10%三氯乙酸(TCA)；双氧水(H2O2，500 μmol/L)；维生素C(Vc)；石油醚(30～60 ℃沸程).以上试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

SY-360型超声波提取机(昆山市超声仪器有限公司)；FW-100型高速粉碎机(上海楚定分析仪器有限公司)；RE-2000型旋转蒸发仪(上海洪旋实验仪器有限公司)等.

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨籽黄酮的提取工艺[24]准确称取刺梨籽粉末5.0 g放入100 mL三角瓶中，加入不同体积分数的乙醇溶液进行超声波辅助提取，过滤得黄酮粗提液，粗提液通过石油醚脱色处理并过滤，所得滤液用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，分光光度法510 nm处测定提取液的吸光值，按照芦丁标准曲线计算刺梨籽黄酮含量.

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制[25]该方法采用硫酸铝显色法.具体流程为：取20 mg标准芦丁样品加入70%(v/v)乙醇溶液溶解定容至100 mL，得到0.2 mg/mL芦丁标准溶液，取6支25 mL具塞试管(编号1-6)依次精确加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准液，同时加入70%(v/v)乙醇溶液定容至10 mL，再分别加入1.5 mL 5%的亚硝酸钠溶液后室温放置6 min，再次分别加入2 mL 10%的硝酸铝溶液并室温放置15 min，分光光度计510 nm处测吸光度值.制得到标准曲线方程:A=2.033 4C-0.000 7(R2=0.997).

1.3.3 单因素试验设计 试验设计4个单因素来考察其对刺梨籽黄酮提取得率的影响，提取液乙醇体积分数选择30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；料液比选择1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70；超声波处理时间选择45、55、65、75、85、95、105 min；超声波功率分别选择为：152、199、247、304、351、399、446 W.

1.3.4 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，以刺梨籽黄酮的提取得率为响应值，以上述4个因素为因变量，设计4因素3水平的响应面优化试验，响应面设计方案为：A：料液比(水平分别为1∶10、1∶20、1∶30)；B：超声时间(水平分别为45、55、65 min)；C：乙醇体积分数(水平分别为60%、70%、80%)；D：超声功率(水平分别为351、399、446 W).

1.3.5 刺梨籽黄酮的抗氧化试验 刺梨籽黄酮DPPH自由基的清除率、羟自由基的清除率以及还原力检测方法分别参考文献[25-26]进行.

1.4 数据处理

本试验中所有检测分别进行3次平行操作和检测，所得数据取得平均值后采用origin 8.0软件以及Excel 2007进行处理.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取液(CH3CH2OH)对刺梨籽黄酮得率的影响 不同体积分数的有机溶剂由于其极性的差异从而对有机物质的浸提产生较大的影响，因此本试验设计运用7种不同体积分数的乙醇溶液来进行刺梨籽黄酮提取最佳溶液的优化试验.试验结果如图1所示.结果表明，随着提取液乙醇体积分数的升高，刺梨籽黄酮的得率也相应得到提高，当乙醇体积分数达到70%时，刺梨籽黄酮得率达到最大值，之后继续增加乙醇的含量，刺梨籽黄酮得率反而开始下降，因此选定70%乙醇溶液作为刺梨籽黄酮提取的最佳溶剂.

2.1.2 液料比对刺梨籽黄酮得率的影响 通常在提取有机物的过程中原料与溶剂的比例也是十分关键的参数.本试验探究了不同液料比对刺梨籽黄酮的得率影响规律，所得结果如图2所示.结果表明，当提取溶剂用量达到20∶1时，刺梨籽黄酮得率达到最大值，若持续增加溶剂的用量，刺梨籽黄酮的得率反而呈缓慢减少的趋势.分析这种现象的原因可能是因为，当液料比达到20∶1时，刺梨籽中黄酮类物质已完全溶出，再增加溶剂的用量，使得黄酮的损失率提高，因此液料比宜选用20∶1.

图1 提取液(CH3CH2OH)对刺梨籽黄酮得率的影响 图2 液料比对刺梨籽黄酮得率的影响

2.1.3 超声波功率对刺梨籽黄酮得率的影响 超声波对细胞膜的通透性有一定的影响，能导致细胞膜和细胞壁受到破坏从而有利于胞内物质的溶出，因此有利于植物细胞中有机物的提取.本试验探究了不同的超声功率对刺梨籽黄酮得率的影响规律，结果如图3所示.结果表明，在超声功率小于399 W时，刺梨籽黄酮的得率随着超声波功率的逐渐上升而上升，在399 W处得到最大值，但在超声功率达到399 W后，刺梨籽黄酮得率随之下降.分析其原因可能是超声功率较高时，溶液温度升高导致黄酮类物质稳定性下降而部分被氧化，致使得率出现下降的结果.因此本试验中超声功率选399 W为宜.

2.1.4 超声波处理时间对刺梨籽黄酮得率的影响 试验在前述研究的基础上，探索了不同超声波处理时间对刺梨籽黄酮得率的影响研究，结果如图4所示.结果表明，当超声时间达到55 min时，刺梨籽黄酮的得率得到了最大值，进而继续增加超声波对刺梨籽黄酮的处理时间，黄酮的得率逐步开始呈下降趋势.分析其原因可能是因为当超声时间达到55 min时，黄酮类物质已基本溶出，进一步延长产生时间，可能导致黄酮受到破坏致使得率降低，因此本试验超声时间定为55 min为最佳.

图3 超声波功率对刺梨籽黄酮得率的影响 图4 超声波处理时间对刺梨籽黄酮得率的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果 结合刺梨籽黄酮提取单因素的试验结果，进行响应面优化试验，所得试验结果如表1所示.

2.2.2 响应面数学模型方差分析结果 对试验得出的数学模型讨论其方差，并对方程的有效性、因子之间的回归系数进行检验，所得结果的方差分析如表2所示.二次回归模型的P<0.000 1，说明了模型具有极高的显著性；同时模型的失拟项P=0.077>0.05，说明所得出的失拟项差异并不显著，可用于超声波提取刺梨籽黄酮的预测和分析.由F检验对自变量、因变量的影响判断，得到各因素对刺梨籽黄酮的得率影响的主要次序是C>D>A>B，即得出结论为：不同体积分数的乙醇溶液对提取刺梨籽黄酮得率影响最大，其次是超声波的功率、液料比，最后是超声时间.同时，表2结果还显示，在此试验设计中，C、AB、BC等项极显著(P<0.01)；A、D项显著(0.01

回归方程为：Y=81.20+3.73A+1.77B+6.46C+4.09D+AB+10.52+0.96AC+1.59AD-9.29BC+3.13BD+2.58CD-12.37A2-19.04B2-22.57C2-24.94D2.

表1 Box-Bwhneken试验结果

Tab.1 The results of Box-Behnken design

试验号黄酮得率/(mg·g-1)试验号黄酮得率/(mg·g-1)184.721637.51242.791742.20367.471852.55429.221934.10550.502025.55640.152137.24739.602254.06849.762355.76940.712483.271079.372652.451151.152645.011220.432781.911323.122833.561432.072976.721542.55

表2 回归模型的方差分析

Tab.2 Regression model variance analysis

方差来源平方和自由度均方F值P值显著度模型8973.2814640.9517.66<0.0001∗∗∗A-液料比166.881166.884.600.0500∗∗B-超声时间37.74137.741.040.3252C-乙醇浓度501.041501.0413.800.0023∗∗∗D-超声功率200.331200.335.520.0340∗∗AB442.471442.4712.190.0036∗∗∗AC3.7113.710.100.7540AD10.14110.140.280.6053BC345.591345.599.520.0081∗∗∗BD39.25139.251.080.3160CD26.57126.570.730.4066A2992.921992.9227.360.0001∗∗∗B22352.3812352.3864.81<0.0001∗∗∗C23356.0113356.0192.47<0.0001∗∗∗D24034.5614034.56111.16<0.0001∗∗∗残差508.121436.29失拟项467.521046.754.610.0771纯误差40.60410.15

结合所有数据分析得到对恩施野生刺梨籽黄酮的最佳的提取条件是：乙醇体积分数为81.36%，液料比为21.94 mL/g，功率为403.54 W，超声时间为55.76 min.在此条件下，刺梨籽黄酮的得率最高，说明模型可以较好地反映出刺梨籽黄酮提取的条件，优化条件也较为可靠.

2.3 刺梨籽黄酮体外抗氧化试验结果与分析

2.3.1 刺梨籽黄酮DPPH自由基清除率试验 在优化刺梨籽黄酮提取工艺的实验基础上，对刺梨籽黄酮的生理活性进一步探索.本试验探究了刺梨籽黄酮提取物对DPPH自由基的效果能力，结果如图6所示.结果表明，在试实验测定的质量浓度范围内，随着Vc、BHT、刺梨籽黄酮提取液的含量增加，DPPH自由基的清除率也增加.当刺梨籽黄酮提取液质量浓度比较低的时候，刺梨籽黄酮提取液的羟自由基清除效果也低于对照品Vc的清除效果，当刺梨黄酮提取液的质量浓度达到0.5 mg/mL时，黄酮提取液的自由基清除效果与Vc的自由基清除效果基本相同，这也说明在作为添加剂使用时，只要使用量调整合理，刺梨籽黄酮的作用与Vc可以达到相同的效果，同时因为黄酮与Vc的其它生理活性有较大的区别，因此在一些不适合使用Vc或者为了达到其它目的的产品中，添加刺梨籽黄酮是完全可行的.

2.3.2 刺梨籽黄酮还原力测定 还原力也是黄酮的主要生理活性的体现，本试验探究了刺梨籽黄酮的还原力并与Vc进行了比较，试验结果如图7所示.吸光度值的升降变化可以反映出样品自身还原力的能力高低，体系的吸光度数值越大，其还原力越强.在本试验所测定的质量浓度范围内，不断增加刺梨籽黄酮的质量浓度时，刺梨籽黄酮的还原力也不断增强.即使达到较高的质量浓度，刺梨籽黄酮提取液的还原力还是低于对照品Vc的还原力.

2.3.3 刺梨籽黄酮对羟自由基清除效果检测 黄酮类物质对羟自由基效果的清除效果也是其重要性质之一，本试验探究了刺梨籽黄酮提取物清除羟自由基效果并与Vc进行了比较实验，结果如图8所示.结果显示，在本试验所测定的质量浓度范围内，随着刺梨籽黄酮和Vc的质量浓度的增加，对羟自由基的清除效果也不断增强.而且当刺梨籽黄酮提取液质量浓度比较低的时候，刺梨籽黄酮提取液的羟自由基清除效果明显低于对照品Vc的清除效果，当刺梨籽黄酮提取液的质量浓度达到0.5 mg/mL时，其对羟自由基清除能力与Vc的羟自由基清除能力差异不显著.

图5 响应面与等高线图Fig.5 Response surface and contour map

图6 DPPH自由基的清除效果 图7 刺梨籽黄酮提取液的还原力Fig.6 Scavenging effect of DPPH free radicals Fig.7 Reducing power of flavonoid extract from Rosa roxbunghii seeds

图8 羟自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of hydroxyl radicals

3 结语

为了达到在刺梨发展产业中原料综合利用的目的，试验优化了刺梨籽中黄酮的提取工艺，并对提取的黄酮进行了活性研究.以刺梨籽为原料，通过有机溶剂乙醇在超声波辅助处理下提取其中的黄酮，在单因素优化的基础上进行了响应面优化试验，得出了刺梨籽黄酮的最佳提取条件，分别为乙醇体积分数为81.36%、液料比为21.94 mL/g、功率为403.54 W、超声时间为55.76 min.此工艺刺梨籽黄酮得率为80.16 mg/g.

通过对体外抗氧化活性的测定，证明了刺梨籽黄酮的提取物确实具有比较好的体外抗氧化活性.在较高的质量浓度下，刺梨籽黄酮对DPPH自由基、羟自由基清除率与传统抗氧化剂Vc差异很小，但其还原性不如Vc.试验结果说明刺梨籽黄酮可作为抗氧化剂的新型来源.这也为促进刺梨开发利用及其产业链的延伸提供了一定的理论和试验数据支撑.