魔芋花粉短期储藏技术及其活力特性研究

赵青华，胡永忠，杨朝柱，潘娅妮，覃 宇

(1.恩施州农业科学院，湖北 恩施 445000； 2.湖北省魔芋种子种苗工程技术中心，湖北 恩施 445000； 3.湖北省农业科技创新中心 鄂西综合试验站，湖北 恩施 445000)

植物花粉携带其全部核基因遗传信息，具有活力的花粉通过发芽和花粉管生长将其携带的基因进行传递[1].自然状态下，大多数植物花粉存活时间有限，如水稻[2]、麦类[3]、玉米[4-5]、匍匐翦股颖[6]等禾本科植物存活时间较短，从几分钟到几小时，猕猴桃[7]室温下可存活不超过40 d，丁香[8]不超过30 d，锦带花[9]为3 d，鸡爪槭[10]为15 d，石斛[11]为5 d，芒果[12]为28 d，二球悬铃木[13]为10 d，梨[14]为60 d以内，而茶树和香蒲花粉也仅能存活120 d[15-16]，远远不能满足植物杂交改良、基因操作和濒危物种的拯救.从20世纪80年代开始，花粉的离体保存技术发展较快，印度、日本、美国、中国等相继建立了植物基因花粉库(Pollen bank)，形成了成熟的保存技术，保存了果树、园林、花卉和蔬菜植物的花粉，部分花粉保存5～10年仍然维持较高活力[17-22].

魔芋属天南星科多年生植物，球茎富含葡甘露聚糖而具有较高的营养价值和商业价值，在我国西南地区种植较多.传统杂交和选择是魔芋品种改良的主要方法，多年的育种实践表明，种内杂交难以获得优势杂种后代，甚至出现严重的退化，种间杂交培育超亲优势品种极具希望[23].魔芋属异花授粉植物，开花期因种属和生长环境而异，集中在4～6月，通过不同温度储藏可以在一定时间内调节花期但难以精确，且魔芋花粉在室温下存活时间很短[24]，定向杂交仍然需要收集和短期保存单株花粉.张玉进等[25]、李勇军等[26]通过低温实现了花魔芋花粉长达6个月以上保存，但需经过复杂的前期处理，且随着保存时间延长，授粉结实率出现明显下降.育种实践中发现授粉结实率低于10%以下的单株出现早衰，很难获得成熟度好的实生籽.因此，本文研究了不同品种未经处理的新鲜花粉在不同条件下的短期保存活力变化，以期为杂交育种实践提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 花粉收集

研究材料种植于湖北省恩施州农业科学院高新技术示范园，花芽长至20 cm左右钵栽，置于防虫网室，待佛焰完全展开附属器散发气味物质后，于上午8时左右用红外热成像仪(FLIR-E63900，T198547，SWEDEN)检测温度变化，当附属器温度明显的高于雄花序于下午5时以后切下雄花序以上部分，用硫酸钠纸袋套住雄花序，置于室温(25～30 ℃，湿度75%左右)过夜，次日上午8时左右自然散粉后及时收集.

1.2 花粉保存

取新鲜花粉，混匀，分装于5 mL螺旋口玻璃瓶，作好标识，密封储藏于不同温度备用，其中室温约25～30 ℃，湿度75%左右，4 ℃和-20 ℃置于普通冰箱(BCD-602W，青岛海尔)冷藏室和冷冻室，-80 ℃置于超低温冰箱(MDF-382E(N)，SANYO电子有限公司)，-196 ℃用细线系住玻璃瓶直接浸入液氮灌中.干燥处理，每瓶中加入1袋0.5 g装硅胶.

1.3 花粉活力检测

花粉活力检测用离体发芽法[27-32].利用正交设计获得优化培养基成份：0.7%(w/v)琼脂，5%(w/v)蔗糖，200 mg/L H3BO3，400 mg/L CaCl2.熔化后取5 mL于直径55 mm培养皿中盖上盖子室，温冷却.花粉解冻参照Ganeshan方法[18]：取出分装花粉玻璃瓶，置于室温下30 min.接种花粉：用不含琼脂的培养基溶液添加0.5%甘油稀释有机硅(烷氧基改性聚三硅氧烷)(华诺生物科技有限公司，山东潍坊)至2 000倍，取20 μL于载玻片上，用镊子挑取少量于室花粉搅拌均匀，迅速用湿润的滤纸条吸附花粉，涂布于冷却的培养基上，倒置培养皿置于人工气候箱(BIC-800，博讯)30 ℃、湿度95%培养3 h.镜检：直接将培养皿放在显微镜(EX20，浙江舜宇光学)4倍物镜拍照(G12，佳能)，随机拍5个视野，每视野花粉数量要求超过100个，3次平行.

1.4 数据分析与处理

花粉颗粒及发芽计数用Image-Pro Plus6.0软件，以花粉管伸长至花粉颗粒直径2倍以上为发芽标准，计算发芽率.图像处理用Adobe Photoshop CS6软件，数据分析和作图用SigmaPlot12.5软件.

2 结果与分析

2.1 魔芋花粉收集时期

魔芋花属佛焰花序，在其肉穗花序底端和顶端分别有佛焰苞和附属器特殊结构.佛焰苞具有保持雌花序周围湿度，造成暗环境有利于花粉萌发.附属器具有发热和散发气味物质的特性，有利于降低花序温度和吸引昆虫授粉.当花粉颗粒成熟后，从雄蕊的顶端的裂孔中吐出.从植株上收集花粉难以控制环境的温度和湿度，无法保证花粉活力且损失多.通过红外图像，发现魔芋吐粉前24 h左右，附属器的温度明显的高于环境和其他部位，如图1所示.此后12 h以内切取雄花序以上部分置于室内，次日上午8时左右及时收集有利于保证花粉的初始活力.

A：白魔芋 B：西盟魔芋 C：花魔芋×白魔芋图1 魔芋花粉收集前24 h红外图像Fig.1 Infrared image of the genus Amorphophallus flowers at 24 h before pollen collected

表1 正交设计筛选魔芋花粉萌发培养基Tab.1 Germination medium (GM) suitable for Amorphophallus spp.(A.konjac × A.albus) pollen

注：试验材料为花魔芋与白魔芋杂交后代花粉.

2.2 花粉离体萌发条件

2.2.1 培养基筛选 以花魔芋和白魔芋杂交后代花粉为材料，通过正交试验，发现蔗糖、硼酸及氯化钙极差分别为11.5%、2.9%、6.0%，如表1所示.表明对魔芋花粉发芽影响蔗糖>氯化钙>硼酸.蔗糖含量过高不利于花粉的萌芽，这可能与增加细胞内渗透压和加速发酵积累了较高含量的酒精有关，二者对花粉的萌发有抑制作用[33].比较理想的魔芋花粉培养基为：5%(w/v)蔗糖，200 mg/L硼酸，400 mg/L氯化钙.

2.2.2 甘油和有机硅对花粉萌发的影响 在预备试验中发现，培养超过4 h后，培养基容易干裂，花粉管出现萎缩，同时花粉颗粒间相互作用导致在培养基表面成团，严重影响后期计数.甘油和有机硅(烷氧基改性聚三硅氧烷)具有良好的保湿和分散作用，常用作保湿剂和农药助剂.在分散液中添加0.5%的甘油，可提高花粉的发芽率，如图2所示，同时避免花粉管干缩.高含量的有机硅增加了花粉细胞渗透压，导致花粉颗粒破裂，影响发芽率，含量过低，分散效果不好，稀释2 000倍的有机硅分散效果好，发芽率比未加提高4个百分点，如图3所示.

2.2.3 离体培养时间 魔芋花粉发芽率与培养时间呈指数关系，如图4所示.在1～2 h之间，上升较快，3 h以后，增加缓慢.培养时间超过3 h，花粉管长度可达2 000 um以上，花粉管相互交错，卷曲，增加了后期计数难度，因此，以培养3 h为计算发芽率，有利于精确统计和节省时间.培养3 h后，花魔芋、白魔芋以及西盟魔芋的发芽率最高的分别为82%、92%和79%.西盟魔芋花粉在不同温度(室温、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃)条件下储藏2 h，发芽曲线明显不同，室温和冷藏较快的达到最高值，而-20 ℃和-80 ℃表现出明显的“滞后”现象，如图5所示.

2.3 不同储藏条件下魔芋花粉活力

2.3.1 硅胶干燥对花粉活力影响 花粉储藏添加干燥剂对魔芋花粉的萌发产生极为明显的影响，如表2所示.

图2 甘油含量对发芽的影响 图3 有机硅含量对发芽影响

A.albus:白魔芋；A.konjac：花魔芋；A.krausei：西盟魔芋图4 魔芋花粉离体培养发芽曲线 图5 不同温度储藏2 h对发芽的影响

表2 硅胶干燥保存对魔芋花粉活力影响Tab.2 Effects on viability of the genus Amorphophallus pollen preserved under different temperature by silica gel drying

注：dry表示保存瓶中加入0.5 g袋装硅胶干燥剂；A.krausei-4，A.krausei-7，A.spp.(A.konjac×A.albus)-10表示西盟魔芋4号、7号单株和花魔芋与白魔芋杂交后代10号单株；小写字母表示1%差异显著性.

除-20 ℃以外，添加干燥剂的花粉活力极速下降，保存2 d内活力显著的低于对照，4 ℃条件下基本上失活，这可能与花粉水分含量有关，加入硅胶导致花粉颗粒过度脱水所致[26].

2.3.2 储存温度和时间对魔芋花粉活力影响 对不同温度条件下储藏1～35 d的西盟魔芋不同单株花粉定期进行活力动态的监测，直线回归表明，储藏温度越低，花粉活力下降越慢.4 ℃和-20 ℃保存，分别经过7 d和14 d其花粉活力降至1%左右；-80 ℃保存，经过35 d后花粉活力下降53%；而液氮(-196 ℃)保存未经任何处理的新鲜花粉，前1～4 d呈“V”，后期逐渐上升，出现“冷适应”现象，保存30 d后，花粉活力仅下降14.6%(图6).室温下魔芋花粉经过6h其发芽率下降60%，10 h后发芽率接近0，如图7所示.

图6 不同温度储藏下魔芋花粉活力变化(西盟魔芋)图7 室温(25～30 ℃)储藏魔芋花粉活力变化(西盟魔芋)

魔芋不同种属(species)、种内不同个体开花期有异，同株雌雄花成熟不一致，散粉后雌花柱头完全失活，自花不实.在品种定向杂交育种实践中，需要配制大量的组合以保证能够选出优良的后代，从4至6月，必须每天确保有充足数量有活力的花粉.因此，保存花粉并在授粉前对花粉活力检测极为重要.从临时(1～4 d)保存效果来看，4 ℃优于-20 ℃，如图8所示.可能是-20 ℃条件下形成了微小的冰针破坏了细胞结构导致其活力迅速下降.短期(1个月左右)以液氮冻存较好，如图9、图10所示.育种实践中，魔芋单株花粉数量少且不同单株基因型不一致，因此要保证花粉足够的活力提高结实率，以增加获得有益性状几率，对不同基因型的91个单株保存于不同温度下34 d左右的花粉进行活力检测，发现4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃平均发芽率分别为0.6%、2.5%、11.1%、34.1%；发芽率超过5%以上的比例分别为3.3%、14.8%、53.3%和100%，如表3所示.由此可见，-196 ℃和-80 ℃储存1个月左右时间效果较好.

(A：-80 ℃；B：-196 ℃，存储21 d；PG：花粉粒，PT：花粉管)图10 -80 ℃和-196 ℃保存21 d西盟魔芋花粉发芽状况Fig.10 Germination of Amorphophallus krausei pollen preserved at -80 ℃ and -196 ℃ for 21 d

表3 91份不同温度储藏34 d左右的魔芋花粉活力情况Tab.3 Viability of 91 the genus Amorphophallus pollen preserved under different temperature for about 34 d

注：小写字母表示1%差异显著性.

3 结论与讨论

延长花粉的寿命对于其生物学研究、植物遗传多样性的保护、杂交育种以及濒危物种的保护具有重要应用价值.花粉的保存可分为室温保存(25～30 ℃)、冷藏(4 ℃)、冻存(-20 ℃)、深度冻存(-80 ℃)和液氮(-196 ℃)超低温保存，其中超低温保存可有效的阻止细胞的代谢和有害物质积累，保持遗传稳定性，是植物花粉长期保存最有效、最经济的方法[1，22，34].但是，超低温保存受条件限制，普通的育种单位难以实现.

魔芋是我国西南山区重要的特色经济作物，育种研究起步晚，早期改良以选择自然变异或优良的地方居群为主，农艺性状很难得到大的提高，杂交育种潜力巨大[23，35-36].魔芋由于雌雄花成熟不一致生理原因导致难以获得遗传上的纯系品种，进一步影响了杂交优势利用，种内个体以及种间杂交花期不遇和地理隔离影响杂交育种.在以往的育种中对花粉进行常规储存(4 ℃和-20 ℃)，授粉前需要进行大量的发芽试验才能筛选出少量活性好的花粉，部分优异的材料花粉失去了活力，关键在于缺乏对魔芋花粉储存条件及活力变化的了解.建立魔芋花短期保存技术体系，对于大规模杂交育种至关重要.

魔芋花粉活力受保存温度影响大，保存温度越低，发芽率下降速度越慢.室温下花粉活力在10 h以内，与前人研究结果一致[24-26].室温下离体收集的新鲜花粉，在4 ℃条件下保存4 d，活力变化不大，可用于杂交临时花期调节.新鲜花粉直接浸入-196 ℃液氮保存，早期下降较快，后期有“冷适应”现象，保存1个月左右花粉仍有很高的活力，可作为短期保存，尤其是一些珍贵的材料宜采用此法.-20 ℃保存花粉效果不佳，可能与水份含量有关，较高的水分导致了冰针形成破坏了细胞结构[22].硅胶干燥处理效果不佳，与张盛林等[24]研究结果类似，与李勇军等[26]在魔芋花粉保存及张铭芳等[37]在百合花粉保存方面研究结果有差异，可能与花粉过度脱水有关[20,26].花粉离体发芽过程中添加0.5%的甘油和稀释2 000倍的有机硅有助于防止花粉管干缩和花粉颗粒在培养基上均匀分布，便于后期准确计数.

魔芋属植物全球超过160种，我国分布有21种以上[38].不同基因型植物花粉保存方法有差异[14-15].对于水份含量高、粘度大的疣柄魔芋、甜魔芋、弥勒魔芋、谢君魔芋等花粉的保存仍旧不成熟，因此，针对不同的魔芋种(Species)，建立适宜的长期保存方法，是下一步研究的重点.