纳米羟基磷灰石增强聚己内酯/明胶纤维膜的制备及其性能

任欣，金蜀鄂，李玉宝，李吉东

（四川大学纳米生物材料研究中心，四川成都610064）

牙周炎是一种可导致牙周组织破坏并最终导致牙齿脱落的多发性炎症性疾病，而牙周组织的功能性修复是临床面临的一大难题[1-2]。在治疗牙周病的方法中，由Nyman 等[3-7]提出的引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）是目前临床上常用的治疗方法，起保护血凝块、维持牙周组织再生空间的作用，同时防止纤维结缔组织竞争性长入的GTR膜在这项技术中发挥着关键作用[8-9]。

目前临床上商品化的GTR 膜包括以膨体聚四氟乙烯（e-PTFE）为代表的不可生物降解膜和以胶原膜为代表的可降解膜[10-11]。虽然不可降解膜具有化学性质稳定、较好的机械强度等优点，但需二次手术取出，因此其应用受到限制[12]。而胶原膜虽能避免二次手术，但是存在降解速度不可控、力学强度低等缺点，可能会引发一些伦理和文化问题[13-14]。因此，研制新型高性能GTR膜仍是生物材料领域的热点之一。

目前，制备GTR 膜的技术包括自组装、相分离、静电纺丝等[15-16]。静电纺丝法因制备的引导组织再生膜具有类细胞外基质结构，这种结构有利于细胞的黏附、迁移、增殖和分化，近年来备受关注。且通过静电纺丝法可以调控膜中纤维的直径、成份、纤维取向以及孔隙率等，实现膜性能调控[17-18]。近年来，包括聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、明胶（Gel）、胶原（Col）和壳聚糖（CS）等聚合物材料均被用来制备GTR 膜[19-23]。其中PCL 因具有可降解、无毒、生物相容性好等特性而备受关注，但纯的PCL纤维膜由于其较强的疏水性而不利于细胞的黏附[24-25]。有研究表明PCL 中加入明胶能够提高细胞活性，促进细胞的黏附、增殖和分化[26-28]。此外，纳米羟基磷灰石（n-HA）作为骨组织中重要组成成分，加入纤维中能提高GTR 膜的生物相容性、生物活性、骨传导性等[29-31]。Rajzer 等[32]通过静电纺丝法将n-HA 混入PLDL 中以制备GTR 膜，并对膜的生物学性能进行了表征，结果表明n-HA的加入能提高细胞黏附性、促进细胞的增殖和分化。

因此，本文采用静电纺丝法制备纳米羟基磷灰石增强的聚己内酯/明胶/纳米羟基磷灰石复合纤维膜，研究n-HA添加量对复合纤维膜力学性能、降解性能的影响，旨在研制出一种既具有良好力学性能，又具有适当降解性能的复合纤维结构引导组织再生膜。

1 材料和方法

1.1 实验材料

PCL（分子量80000g/mol）购自深圳光华伟业股份有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和三氟乙醇（TFE）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；乙酸（分析纯）购自成都金山化学试剂公司；明胶、无水乙醇购自成都科龙化工试剂厂。根据文献所述方法实验室自制n-HA[33-34]。

1.2 主要仪器

扫描电镜（SEM，JSM-6500LV，JEOL）；X射线衍射仪（XRD，DX-2500，丹东方圆）；热重分析仪（TG，TGA/DSC-2,Mettler Toledo）；红外光谱仪（FTIR，Nicolet 6700，美国热电）；电子万能试验机（AG-IC50，日本岛津）；静电纺丝机（Ucalery，北京永康乐业）；透射电镜（TEM，Tecnai G2 F20 S-TWIN，美国FEI公司）等。

1.3 静电纺丝法制备纳米纤维膜

将n-HA 加入装有适量四氟乙烯（TFE）溶剂的锥形瓶中，超声分散1h。然后在不断搅拌下将PCL（质量）和Gel（体积）比例为13%溶于锥形瓶中。待PCL/Gel 完全溶解后加入体积分数为3%的乙酸混合均匀，得到共混纺丝液，备用。按mPCL/Gel∶mn-HA分别为100∶0、100∶5、100∶10、100∶15（其中mPCL∶mGel=7∶3），即可得到四种纺丝溶液，记为P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15。

在纺丝电压为-2kV/6kV、接收板距离为15cm、推注速度为0.45mL/h 的参数下进行纺丝即可制得不同n-HA 含量的纤维膜，将制得的膜在50/50（mmol/L）的EDC/NHS 乙醇交联液中交联24h，然后用无水乙醇洗除膜上残留的交联剂，真空干燥，备用。

1.4 纳米纤维膜理化性能表征

形貌表征：取下收集在铝箔上的纤维膜，喷金，然后在20kV 加速电压下用SEM 观察其形貌。根据SEM 照片，采用Image J 分析软件，随机测量纤维直径（d≥100），计算纤维平均直径及直径分布范围。采用TEM观察纤维中n-HA的分布。

TG：在氧气氛围中，通过热重分析表征纤维膜的热学特性以及n-HA在膜中的实际含量。测试温度范围为30～550℃，升温速率为10℃/min。

XRD 分析：采用X 射线衍射分析仪对纤维膜进行物相分析，测试条件：铜靶（λ=0.15418nm），管电压为40kV，管电流为25mA，扫描速度为0.03°/min，扫描范围为5°～80°。

FTIR 分析：采用红外光谱仪对交联后的纤维膜进行红外光谱分析（4000～650cm-1）。

力学性能表征：将交联后的纤维膜制成10mm×50mm 的样条，运用电子万能试验机测量膜的抗拉强度和断裂伸长率，拉伸速度为10mm/min，每组5个平行样。

1.5 降解实验

将纤维膜剪成10mm×10mm的矩形，称取质量后装入5mL离心管中，加入3mL PBS溶液。然后将离心管置于摇床中，于37℃，150r/min条件下进行体外降解实验。每2天更换一次PBS溶液。最后将纤维膜在设定的时间点取出，蒸馏水清洗，干燥后称重。每组材料设置5个平行样。

2 结果与讨论

2.1 纤维膜形貌

图1 不同n-HA含量纤维膜交联前的扫描电镜图、纤维直径分布图和透射电镜图

图2 不同n-HA含量纤维膜交联后扫描电镜图和纤维直径分布图

由图1可知，各纤维膜的纤维形态良好、无串珠纤维形成，纤维直径主要分布在200～400nm，纤维平均直径随n-HA含量的增加而降低。这是因为在PCL/Gel 溶液中添加n-HA 可增加溶液的导电性，从而使得带电射流在电场中所受的拉伸力增加，纤维直径降低[35]。此外，随着n-HA 含量的增加，在纤维膜表面逐渐有n-HA颗粒的聚集，且纤维局部出现凸起，TEM 结果表明纤维中凸起部分为n-HA含量较高的地方；另外，从TEM结果可以看出n-HA含量为5%和10%时，n-HA较均匀地分散在纤维中，当n-HA 含量为15%时，n-HA 分散不均匀且会出现团聚并凸起于纤维表面。图2为纤维膜交联后照片，从图中可以看到，交联后膜仍保持较好的纤维结构，但纤维发生溶胀，使得纤维直径增加。当纤维与交联溶液接触时，溶剂分子沿着纤维的微隙进入到无定形区，削弱了纤维大分子间的作用力，使分子间的距离加大，空隙增大，纤维发生溶胀，纤维直径增加[36]。

2.2 红外光谱

图3 不同n-HA含量的纤维膜红外谱图

2.3 XRD

图4 n-HA和不同n-HA含量纤维膜的XRD谱图

复合材料的结晶性能影响材料的其他理化及力学性能，因此，通过XRD 分析所制备的复合纤维膜的结晶状态。从图4 可以看出，n-HA 在2θ=25.9°和2θ=31.9°处存在明显的特征峰，P7G3 膜在2θ=21.6°和24.0°处出现PCL特征衍射峰。由图4可知，n-HA 加入后纤维膜中PCL 的特征衍射峰未发生明显变化，这说明n-HA的加入对PCL的结晶状态影响较小，主要是因为n-HA 与PCL/Gel 之间没有化学反应，只存在较弱氢键作用，这些作用力未影响到材料分子链的排列，因此，n-HA 的加入未改变PCL 的结晶结构[41]。此外，从图4 可以看出，随着n-HA 含量的增加，n-HA 的特征衍射峰逐渐增强。当n-HA含量为5%时，基本观察不到n-HA的特征衍射峰；当n-HA 含量为10%时，有n-HA特征衍射峰出现，但峰强度较低；当n-HA含量为15%时，能明显观察到n-HA特征衍射峰，其峰强度也增加。主要是因为n-HA含量较低时，低含量的n-HA 被包裹在纤维内部，从而没有显现出n-HA 的特征衍射峰；而随着n-HA 增加，分散在纤维表层的n-HA 增多，因此n-HA 的特征衍射峰逐渐出现，且峰强度随着n-HA 含量增加而逐渐增强。

2.4 热重

图5 纤维膜的热重曲线

图5是P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15 纤维膜的热重曲线。从图中可以看出，P7G3 膜的起始分解温度为182℃，加入n-HA后，复合膜的起始分解温度升高，不同n-HA含量的纤维膜具有相近的起始分解温度（250℃）和最大分解温度（368℃），说明n-HA 的加入显著改善了PCL/Gel纤维膜的热稳定性，但在本文报道的n-HA 含量范围内，n-HA 的添加量对纤维膜的热稳定性无明显影响。n-HA 加入提高膜的热稳定性主要是由于纳米级的n-HA具有很高的比表面积和较强的表面键合能力，在n-HA的作用下材料结构变得紧密，稳定性提高，分子运动需要更多的能量，从而使得添加有n-HA 的纤维膜具有更好的稳定性[42]。此外，从图中可以看出，P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15 纤维膜分解后的残余量与实验中n-HA的添加量基本一致。

2.5 力学测试

图6 纤维膜应力-应变曲线及力学强度统计直方图

图6是不同n-HA含量的纤维膜的应力-应变曲线及拉伸强度统计直方图。图中可看出，n-HA 加入后纤维膜的拉伸强度和伸长率显著增加，且随着n-HA 含量的增加，纤维膜的拉伸强度和伸长率逐渐增加，当n-HA 含量为15%时，相较于P7G3 纤维膜，其拉伸强度和伸长率分别增加203%和240%，达到9.18MPa和180%。其原因可能是n-HA自身粒径较小，比表面积大，与PCL/Gel 混合后，在物理吸附和氢键的作用下与PCL/Gel 产生较强的界面作用，当存在外力作用时，由于n-HA与PCL/Gel 之间的应力场作用使得n-HA 牢固黏附在基体中，且会在纤维中快速产生许多微裂纹，这些微裂纹一方面吸收外应力，另一方面提高基体屈服能力，从而使得纤维材料的拉伸强度和伸长率增加[43]。这一结果与有关文献报道一致[44-45]。Masoudi等[45]制备了β-TCP 含量为5%、10%和15%的PGS/PCL/β-TCP 纤维膜，力学测试结果表明，随着β-TCP 含量从5%增加到10%，纤维膜的拉伸强度和杨氏模量也增大，但当β-TCP 含量为15%时，纤维膜的拉伸强度和杨氏模量出现下降，这是β-TCP出现较严重的团聚造成的。

GTR 膜需要有良好的力学强度才能满足临床手术中的可操作性要求以及在组织再生过程中提供力学支撑。Fu等[31]采用静电纺丝法制备了PLGA/n-HA 纤维膜，并表征了不同n-HA 添加量下纤维膜的力学性能，结果表明纤维膜的力学强度随着n-HA 含量的增加出现先增后降的趋势，当n-HA 添加量为5%时，力学强度达到最大值（3.55±0.55）MPa。Linh 等[28]通过静电纺丝制备了n-HA 含量为10%、30%和50%的HA-PCL/Gel膜（其中PCL/Gel比例为5∶5），虽然所制备的纤维膜n-HA 含量较高，但纤维直径（0.12～3.0μm）分布不均，且n-HA 多分布在纤维表面，力学性能测试结果表明纤维膜的拉伸强度随着n-HA 含量的增加从(1.8±0.1)MPa增大到(3.7±0.2)MPa。而本文制备了n-HA添加量为5%、10%以及15%的n-HA-PCL/Gel 膜，力学性能测试结果表明所制备的纤维膜的拉伸强度均远远大于文献中所报道的拉伸强度。此外，本文中n-HA 最高添加量为15%，这是因为纺丝溶液中PCL 含量较大，当n-HA 含量为20%时，纺丝溶液黏度较高，纺丝变得困难。

2.6 降解实验

图7是纤维膜在不同时间点降解后的质量剩余曲线。由图可知，纤维膜在14 天之前均具有一个快速降解过程，P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15在第14天剩余质量分数分别为(74.96±1.51)%、(81.25±0.76)%、(88.42±2.92)%、(86.91±0.64)%，随后降解速度变慢，但与P7G3 纤维膜相比，n-HA 加入后纤维膜的降解速率明显下降。复合膜的降解主要是有机高分子的降解，n-HA 加入后，复合膜中有机高分子含量相对降低，故降解速率也较慢。

图7 纤维膜体外降解图

3 结论

通过静电纺丝法成功制备了一种n-HA增强增韧的PCL/Gel GTR纤维膜，纤维膜的形貌、力学性能及体外降解性能研究结果表明制备的纤维膜中纤维形态良好，纤维直径分布于200～400nm，n-HA较均匀分散在纤维中，随着n-HA含量的增加，纤维膜表面以及纤维内出现n-HA的聚集；交联后纤维直径明显增加。添加n-HA能显著提高纤维膜的力学性能，随着n-HA含量的增加，其拉伸强度逐渐增大，当n-HA含量为15%时，其拉伸强度达到9.18MPa、伸长率达到180%。此外，n-HA 的添加降低纤维膜的降解速率。本文制备的n-HA/PCL/Gel纤维膜力学性能较佳，在GTR领域具有较大的应用潜力。