发酵法制取蓝莓果渣可溶性膳食纤维工艺优化及其特性分析

杜斌，冯军，李苗苗，周笑犁，孙情，孟令帅

（贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005）

蓝莓（blueberry），又称越橘，杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium L.）植物，其果实富含多种营养物质，有着“水果皇后”的美誉[1-2]。同时，蓝莓果实中富含具有抗氧化、抗癌和抗炎作用的多酚类化合物和多糖类物质，因此有着极强的药用价值及营养保健功能[3-5]，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，具有广阔的开发应用前景。近年来，蓝莓种植面积在贵州省逐年扩大，黔东南州已成为西南地区乃至全国的重要蓝莓种植基地，其蓝莓深加工产业也随之发展迅速，而蓝莓皮渣作为加工后的的副产物也随之増加。研究发现，蓝莓果渣中依然含有大量的营养成分，如花青素，有机酸，膳食纤维等[6]。而目前对于蓝莓皮渣通常以废弃物的形式丢弃，这样不但会形成巨大的环境压力，同时也造成了资源的巨大浪费。因此，对于蓝莓皮渣进行的有效处理，成为提高蓝莓综合利用价值必然的发展趋势。

膳食纤维（dietary fiber，DF）是既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量的多糖类物质的总和。因其重要的生理作用被营养学界补充认定为第七类营养素。研究发现膳食纤维具有防止排泄系统疾病、预防肥胖症、降血压、改善肠道菌群等功能，而这些功能又都与可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）有很大的关系[7-10]。目前，化学法是提取膳食纤维最为常见的方法，虽然其具有制备成本较低等优点，但在处理过程中带入大量阴阳离子，制取的膳食纤维含量较低，色泽差，给膳食纤维的进一步利用带来不利影响。本研究以蓝莓蓝莓果渣为原料，以乳酸菌为发酵菌种，采用微生物发酵法制备蓝莓果渣可溶性膳食纤维，为蓝莓果渣资源的高值转化利用，延伸蓝莓加工产业链，提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果渣：贵州麻江蓝莓经榨汁等加工后的副产物，由贵阳学院贵州省高校功能食品重点实验室-20 ℃冷冻保存；植物乳杆菌-YRA7：分离自侗族传统酸肉[11]，贵阳学院贵州省果品加工工程技术研究中心实验室保存；嗜酸杆菌：中科院微生物研究所菌种保藏中心；MRS 培养基：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

AUW120D 电子分析天平：日本岛津公司；TGL-16C 高速台式离心机：北京市永光明医疗仪器厂；SHA-B 数显水浴恒温振荡器：常州澳华恩斯仪器有限公司；LDZX-30KBS 高压灭菌锅：上海申安有限公司；SPX-250B-Z 生化培养箱：上海博讯实业有限公司；SW-CJ-1G 超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司

1.3 工艺流程

蓝莓果渣→调配→灭菌→接种→发酵→灭活→离心取上清液→醇析→抽滤→干燥→SDF

200 mL 锥形瓶中加入20 g 蓝莓果渣，按一定料液比加入蒸馏水，并分别加入2%的脱脂奶粉和白砂糖，混合均匀后灭菌；冷却至室温25 ℃后，按一定的接种量接入发酵菌种，在一定温度下发酵一定时间后取出，5 000 r/min 离心15 min，收集上清液；向上清液中加3 倍体积的95 %乙醇，抽滤分离SDF，干燥至衡中后称重并记录，所得产物为蓝莓果渣SDF。

1.4 试验方法

1.4.1 发酵菌种的培养

取植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌（1 ∶1 混合菌种）接入MRS 培养基，37 ℃培养 24 h～48 h，采用平板计数法计数，调整细菌数含量在107CFU/mL～108CFU/mL。

1.4.2 单因素试验

1.4.2.1 料液比对蓝莓果渣SDF 得率的影响

称取20 g 蓝莓果渣置于250 mL 锥形瓶内，按料液比 1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL），pH 值为 6.0，接种量10%，37 ℃发酵36 h，测定SDF 含量。

1.4.2.2 发酵时间对蓝莓果渣SDF 得率的影响

称取20 g 蓝莓果渣置于250 mL 锥形瓶内，按料液比 1 ∶5（g/mL）pH 值为 6.0，接种量 10%，37 ℃分别培养 24、36、48、60、72 h，测定 SDF 含量。

1.4.2.3 发酵温度对蓝莓果渣SDF 得率的影响

称取20 g 蓝莓果渣置于250 mL 锥形瓶内，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值为 6.0，接种量 10%，分别调整温度为 28、31、34、37、40、43 ℃发酵 36 h，测定 SDF含量。

1.4.2.4 pH 值对蓝莓果渣SDF 得率的影响

称取20 g 蓝莓果渣置于250 mL 锥形瓶内，按料液比 1 ∶5（g/mL），接种量 10%，分别调整 pH 值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37 ℃发酵 36 h，测定 SDF 含量。

1.4.2.5 pH 值对蓝莓果渣SDF 得率的影响

称取20 g 蓝莓果渣置于250 mL 锥形瓶内，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值为 6.0，分别按接种量 6%、8%、10%、12%、14%接入发酵菌种，37 ℃发酵36 h，测定SDF 含量。

1.4.3 正交试验

在单因素试验的基础上，每个因素选取3 个对SDF 得率影响较大的水平，以SDF 得率为指标，选取五因素三水平的L18（35）正交试验进行工艺条件优化，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4.4 蓝莓果渣SDF 持水力和膨胀力分析

1.4.4.1 持水力分析

参照周笑犁等的方法进行[12]，准确称量质量为1.00 g（m1）的 SDF 样品，并将其加入 20 ℃的去离子水中1 h。将其倒入滤纸漏斗上过滤，待水滴干后，然后转移至质量为m2的表面皿，准确称其质量（m3）。

1.4.4.2 溶胀性分析

称取质量为1.000 0 g（m）的SDF 样品，将其置于20 mL 量筒中，测量体积（v1），准确吸取 10 mL 蒸馏水于量筒中，均匀摇动，在室温25 ℃下静置24 h 后，读取 SDF 膨胀后的体积（v2）。

1.4.5 蓝莓果渣SDF 吸附性能分析

1.4.5.1 蓝莓果渣SDF 对油脂的吸附作用

参照Sangnark 等[13]的方法进行。分别取1.00 g（W1）SDF 于离心管中，各自加入食用花生油（不饱和脂肪）或猪油（饱和脂肪），室温25 ℃静置1 h，用尼龙网（重量为W2）过滤收集沉淀，称取湿重W3。

1.4.5.2 蓝莓果渣SDF 对葡萄糖的吸附作用

称取1.00 g 样品于50 m L 的离心管中，加入20 mL的 50 mmol/L 的葡萄糖溶液，室温25 ℃静置2 h，6 000 r/min 离心20 min，采用DNS 法测定上清液中葡萄糖的浓度，根据反应前后的浓度差别计算蓝莓果渣SDF 对葡萄糖的吸附量[14-15]。

1.4.5.3 蓝莓果渣SDF 对亚硝酸盐的吸附作用

在250 mL 锥形瓶中，加入50 mL 100 μmol/L NO2-溶液和一定量的膳食纤维，调整pH 值为7.0，于室温下振荡2 h 后，取1 mL 样液按盐酸萘乙二胺方法测定其中NO2-含量，计算吸附后溶液中残余NO2-吸附量[14-15]。

NO2-吸附量=（吸附前 NO2-含量- 吸附后 NO2-含量）/膳食纤维质量。

1.5 数据统计分析

数据用平均值±标准差表示。用SPSS 22.0 进行统计分析，以p＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 料液比对蓝莓果渣SDF得率的影响

在微生物发酵过程中，料液比过低而导致菌种和原料接触不充分，使发酵不彻底，而过高则不利于乳酸菌菌体产酶代谢[14，16]。料液比对可溶性膳食纤维产率的影响见图1。

图1 料液比对可溶性膳食纤维产率的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the SDF yield

由图1 可知，随着溶剂体积的增大，蓝莓果渣SDF的得率也随之增加，当液料比为 1 ∶5（g/mL）时，SDF得率显著增加，明显高于其他各组（p＜0.05）。因此，确定最佳料液比为 1 ∶5（g/mL）。

2.2 发酵时间对蓝莓果渣SDF得率的影响

发酵时间对可溶性膳食纤维产率的影响见图2。

图2 发酵时间对可溶性膳食纤维产率的影响Fig.2 Effects of fermentation time on the SDF yield

如图2 所示，蓝莓果渣SDF 得率随着发酵时间延长而升高，发酵到48 h 后，3 个组间SDF 得率均差异不显著，并且在72 h 出现了小幅下降（p＞0.05）。可能是由于发酵时间过长，菌种增长致使发酵产物（如乳酸等）不断的积累，使发酵体系pH 值不断下降，果胶在水中被氢离子水解，同时在酸性环境下，使菌体产酶效果下降从而导致发酵能力的下降所致[14，16-17]。因此，确定最佳发酵时间为48 h。

2.3 发酵温度对蓝莓果渣SDF得率的影响

发酵温度对可溶性膳食纤维产率的影响见图3。

由图3 可知，随着发酵温度的上升，SDF 得率随之增加，37 ℃时SDF 得率最高达12.80%。当温度超过37 ℃时，SDF 得率开始显著下降（p＜0.05）。这一现象一方面可能是由于温度升高导致SDF 分子的自身结构遭到破坏[18]，另一方面温度过高会抑制乳酸菌的生长不利于发酵的进行[14，16]。因此，选择最佳发酵温度为37 ℃。

图3 发酵温度对可溶性膳食纤维产率的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on the SDF yield

2.4 pH值对蓝莓果渣SDF得率的影响

pH 值对可溶性膳食纤维产率的影响见图4。

图4 pH 值对可溶性膳食纤维产率的影响Fig.4 Effects of pH on the SDF yield

由图4 可知，在pH 值为4.0 时，发酵速度较慢，且SDF 得率较低（p＜0.05）。pH 值为 5.0 和 6.0 是，SDF 得率最高，两组差异不显著（p＞0.05），且明显高于其他各组（p＜0.05）。而当 pH 值 高于 6.0 时，得率迅速下降（p＜0.05），提示发酵菌种乳酸菌具有较强的耐酸性，在偏酸的环境下进行发酵适于它们的生长和代谢，而当pH值升高时，抑制了菌体的自身生长，使菌体产酶效果下降从而导致发酵能力下降。因此，选择6.0 为最佳发酵pH 值。

2.5 接种量对蓝莓果渣SDF得率的影响

接种量对可溶性膳食纤维产率的影响见图5。

如图5 所示，随着接种量的增加，蓝莓果渣SDF得率不断增大，当接种量为12%时，SDF 得率最高（p＜0.05）。当接种量大于12%时，SDF 得率明显下降（p＜0.05）。提示，接种量低，菌体生长缓慢，发酵不彻底。而接种量过高，则导致菌体生长过于旺盛，使培养液营养快速消耗，引发后续发酵动力不足，SDF 得率下降[16]。因此，确定12%接种量较适宜。

图5 接种量对可溶性膳食纤维产率的影响Fig.5 Effects of inoculation quantity on the SDF yield

2.6 发酵法制取蓝莓果渣可溶性膳食纤维工艺的优化

通过对各个单因素进行初步分析后，选取发酵时间、料液比、接种量、发酵温度和pH 值这5 个因素，以单因素试验为基础，以蓝莓果渣SDF 得率为指标进行正交优化试验。试验结果及直观分析见表2。

表2 正交试验结果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

由表2 极差分析可知，影响蓝莓果渣SDF 得率的各因素主次顺序为B＞A＞E＞C＞D，即料液比＞接种量＞pH 值＞发酵温度＞发酵时间。方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3 方差分析表可以看出，料液比对蓝莓果渣SDF 得率影响显著。由正交试验结果分析可得发酵法制备蓝莓果渣SDF 的最适工艺条件为A2B3C1D2E2，即接种量 12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、发酵温度 34 ℃、发酵时间48 h、pH 6.0。在此条件下进行验证试验，结果可得蓝莓果渣SDF 的平均得率可达到15.92%，可溶性膳食纤维产品呈淡紫色、质构蓬松、无味。

2.7 蓝莓果渣SDF持水力和膨胀力

作为衡量膳食纤维品质的重要指标，水力和膨胀力值越大就表明其吸附性能越强，并且较高的持水力有利于防止便秘和结肠癌的发生[19-20]。膳食纤维特性分析见表4。

由表4 可知，发酵法制备的蓝莓果渣可溶性膳食纤维的持水力和膨胀力均高于果渣组（p＜0.05）。同时，吸附能力试验结果显示，蓝莓果渣可溶性膳食纤维对油脂、葡萄糖以及亚硝酸盐的吸附能力均高于原果渣。其中对油脂的吸附能力为（2.35±0.06）（g/g）（不饱和脂肪）和（1.67±0.05）（g/g）（饱和脂肪），均高于钟希琼等报道的米糠、甘薯、马铃薯和葛根等膳食纤维对油脂的吸附量[21]；对葡萄糖的吸附量为（1.40±0.62）mmol/g，高于豆渣、麦麸及玉米膳食纤维的吸附能力[15]；对亚硝酸盐的吸附量为（50.39±0.37）μmol/g，优于已报道的大豆、魔芋、燕麦以及菠萝膳食纤维[22-23]。结果表明，发酵法制备的蓝莓果渣可溶性膳食纤维是一种优质的膳食纤维资源。

表4 膳食纤维特性分析Table 4 Character analysis of SDF

3 结论

本试验以蓝莓果渣为原料，在单因素试验的基础上，通过正交试验获得采用乳酸菌发酵法制备蓝莓果渣可溶性膳食纤维的最佳工艺条件，即菌种的接种量12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、发酵温度 34 ℃、发酵时间48 h 以及pH 6.0；此条件下蓝莓果渣可溶性膳食纤维的的率为15.92%，高于非发酵条件下的可溶性膳食纤维得率[24]，说明采用乳酸菌发酵可以明显地提高可溶性膳食纤维的得率，并且发酵法得到的膳食纤维膨胀力、持水力以及对油脂、葡萄糖以及亚硝酸盐的吸附能力均比原果渣有所提高，符合高质量膳食纤维的要求。本研究方法操作简单，发酵时间短，成本低，为推动蓝莓果渣资源的综合利用提供了新的途径，也为利用蓝莓果渣膳食纤维开发保健食品的应用提供一定的理论依据。