三斑海马蛋白ACE抑制肽的制备及其二级结构的研究

石杰，宿瑞奇，张文婷，陈健

（海南大学食品科学与工程学院，海南海口570228）

近年来，高血压日益成为影响世界上多数国家30%成年人的流行疾病。作为一种严重的慢性疾病，它能引起动脉硬化、中风、心肌梗塞等高危疾病。同时，高血压患者也呈现低龄化发展趋势[1]。因此，寻求有效治疗高血压的方法迫在眉睫。血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）（EC 3.4.15.1） 是一种锌金属肽酶，通过肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）和激肽释放酶激肽系统（kallikrein kinin system，KKS）对血压起调节作用[2]。基于ACE作用原理，现已研发了一些合成的ACE 抑制剂，包括卡托普利（captopril），赖诺普利（lisinopril），依那普利（enalapril）和阿拉普利（alacepril）。它们对治疗高血压具有显著疗效，但也伴随着咳嗽、味觉紊乱、皮疹、血管神经性水肿等明显的副作用[3]。因此，开发无毒、经济、安全有效的ACE 抑制剂显得尤为重要。

三斑海马（Hippocampus trimaculatus Leach）是一种隶属于海龙科的海洋硬骨鱼，主要分布在亚热带、热带的浅海区域[4]。近年来的研究表明其体内富含甾体类、蛋白质、脂肪酸、磷脂类等活性成分，特别是蛋白质含量高达67.90%～73.56%（干重）[5-6]。三斑海马作为亚洲地区传统的海洋中药材，具有抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、抗衰老等生理功效[5-6]，因而具有广阔的开发和应用前景。

众所周知，海马作为海洋药源性和观赏性动物，具有极高的中医药价值。现有研究主要是海马种群分布[7]、水溶性[8]或脂溶性[9]成分分析、长链碱[4]、糖脂[10]等，关于海马蛋白提取的研究比较少。目前，人们已从多种海洋生物蛋白中分离得到ACE 抑制肽，如鲑鱼[3]、蜥蜴鱼[11]、太平洋鳕鱼[12]等，这些研究表明海洋生物蛋白可作为提取ACE 抑制肽的重要来源。然而，关于海马ACE 抑制肽的分离纯化尚未见到报道。

本试验以三斑海马为原料，以ACE 抑制活性为指标。通过酶解，连续色谱分离，并对反相高效液相色谱分离得到的ACE 抑制活性最高组分进行质谱鉴定，成功分离得到一种ACE 抑制肽，并分析其二级结构。本研究为三斑海马蛋白的提取，开发治疗高血压的功能性食品提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三斑海马干品：海南龙盛生物科技发展有限公司；血管紧张素转化酶（ACE）（来源于兔肺，2.0 U/mg）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）：美国 Sigma 公司；碱性蛋白酶（2×106U/g）、葡聚糖凝胶 G-25：北京索莱宝科技有限公司；乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

真空干燥箱（AY-DZF-6210）：上海尚群电子科技有限公司；恒流泵（HL-2）：苏州江东精密仪器有限公司；电子天平（AUW220）：厦门群隆仪器有限公司；电脑自动部分收集器（DBS-160F）：上海精科实业有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：江苏盛蓝仪器制造有限公司；冷冻干燥机（ALPHA 1-2）：北京五洲东方科技发展有限公司；紫外可见分光光度计（UV757CTR）：上海仪电分析仪器有限公司；反相高效液相色谱仪（Agilent 1260）：美国安捷伦科技有限公司；圆二色光谱仪（Chirascan）：英国应用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 脱脂三斑海马粉末的制备

将三斑海马干品用蒸馏水洗净，并去除内脏等，电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎，过60 目筛。称取一定质量的三斑海马粉末置于烧杯中，按料液比1 ∶6（g/mL）加入乙酸乙酯，恒温磁力搅拌器上脱脂30 min，抽滤，收集滤液，重复脱脂过程3 次，将脱脂处理的三斑海马粉末于烘箱中40 ℃蒸干乙酸乙酯。

1.3.2 三斑海马酶解产物的制备

参照徐克寒等[13]的方法，使用碱性蛋白酶，在其最适温度和pH 值条件下，制备三斑海马酶解产物。称取适量脱脂三斑海马粉末，按料液比1 ∶15（g/mL）加入去离子水，混匀，调节pH 值至9.5，按1.0%加酶量，60 ℃酶解6 h，沸水浴10 min 灭酶，终止反应。酶解液冷却至 25 ℃，抽滤收集滤液，离心（5 000 r/min，20 min），取上清液，冷冻干燥成粉末，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3 分离和纯化ACE 抑制肽

1.3.3.1 透析

对三斑海马酶解液进行透析处理。4 ℃条件下，将酶解液于置于磁力搅拌器上透析72 h，每隔6 h～8 h 换一次超纯水，透析完后冷冻干燥得到透析产物，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3.2 Sephadex G-25 凝胶柱分离纯化

选用Sephadex G-25 凝胶对透析产物进行分离纯化，将预处理好的葡聚糖凝胶采用自然沉降法装填至1.6 cm×90 cm 的玻璃层析柱中，平衡4 h～5 h，调节流速至0.3 mL/min，透析产物溶于超纯水配成50 mg/mL溶液，过0.45 μm 针孔式滤膜，上样体积2 mL，用超纯水洗脱，自动部分收集器每10 min 收集一管，检测波长280 nm，按峰分别多次收集洗脱液，冷冻干燥，-20 ℃隔光隔氧保存。

1.3.3.3 反相高效液相色谱分离纯化

将Sephadex G-25 凝胶层析分离得到的ACE 抑制活性最强组分以超纯水（含0.1%TFA）溶解，配成30 mg/mL 溶液，过 0.22 μm 针孔式滤膜，以反相高效液相色谱仪分离纯化，按峰分别多次收集洗脱液，冷冻干燥，测定各组分峰ACE 抑制活性。

色谱条件：ODS HYPERSIL C18（10 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；上样量：100 μL；洗脱流速：3 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：215 nm；流动相 A：超纯水（含0.1%TFA）；流动相 B：乙腈（含 0.1 % TFA）；洗脱条件：0～10 min，10%B，10 min～50 min，10%～42%B。

1.3.4 测定ACE 抑制活性

参照Ko 等[14]的方法测定ACE 抑制活性，稍做修改后使用。取50 μL 待测样品溶液和150 μL 8.3 mmol/L HHL 溶液（含 0.3 mol/L NaCl，pH 8.3）于 2 mL 离心管中，混匀，37 ℃水浴预热 5 min 后，向离心管中加入 50 μL 0.025 U/mL ACE 溶液（ACE 溶于含 0.3 mol/L NaCI 硼酸缓冲液，pH 8.3），混匀，于 37 ℃水浴 1 h 后，加入 250 μL 1 mol/L HCl 溶液终止反应，混匀。再加入1.5 mL 乙酸乙酯萃取反应生成的马尿酸，混匀，离心（3 000 r/min，10 min），移取 1 mL 上清液于 5 mL 离心管中，真空浓缩3 h 蒸干乙酸乙酯，再加3 mL 去离子水复溶，混匀，于228 nm 波长处测定吸光度值。按下式计算ACE 抑制率。

式中：AS为样品组的吸光度值；AB为空白组的吸光度值；AC为对照组的吸光度值。

1.3.5 鉴定ACE 抑制肽的氨基酸序列和分子量

委托生工生物工程（上海）股份有限公司鉴定反相高效液相色谱纯化得到的ACE 活性最高组分的氨基酸序列和分子量。样品溶于0.1%甲酸水溶液，自动进样器上样于LTQ Orbitrap Velos Pro 质谱仪。仪器使用前经丁螺环酮标准校准液校正。正离子检测，离子源为ESI，喷雾电压：1.8 kV，离子传输毛细管温度：250 ℃，扫描范围：50 m/z ～750 m/z，质谱扫描方式为信息依耐采集工作模式，碎裂方式为碰撞诱导解离。使用Mascot 2.3 软件从海马数据库中自动匹配得到多肽序列。

1.3.6 圆二色光谱分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司使用圆二色光谱法分析纯肽的二级结构。取适量样品溶于20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2），使其浓度为0.2 mg/mL，取200 μL 溶液上样于圆二色光谱仪，使用石英比色皿，在 25 ℃、190 nm～260 nm 条件下扫描，带宽1.0 nm，扫描速率120 nm/min，磷酸盐缓冲液作为空白，实验重复三次。采用CDNN 软件计算α 螺旋，β 折叠，β 转角和无规则卷曲的含量。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱

在红外灯照射下，取适量ACE 抑制活性最强的层析分离组分，与KBr 粉末混匀，充分研磨后压成透明薄片，通过傅里叶变换红外光谱仪，在4 000 cm-1～400 cm-1内测定ACE 抑制活性最强的层析分离组分红外吸收光谱。

1.3.8 试验数据处理

采用SPSS 21.0 分析试验数据，试验数据以平均值±标准差（）表示，Origin Pro 9.1 软件作图，采用ANOVA 分析数据间差异，P＜0.05，表示差异有显著意义。

2 结果与分析

2.1 三斑海马酶解产物的制备

多项研究表明，碱性蛋白酶酶解食源性蛋白质得到的产物具有潜在的生物活性，如抗氧化活性[15-16]和ACE 抑制活性[17-18]。这些多肽的生物活性归因于碱性蛋白酶具有内切肽酶的性质。此外，碱性蛋白酶酶解蛋白质产生的短肽序列，可解释这些生物活性，包括ACE 抑制活性[19-20]。试验中选用碱性蛋白酶酶解三斑海马制备富含ACE 抑制肽的酶解产物，其IC50值为（0.81±0.12）mg/mL。因为酶解产物具有ACE 抑制活性，证明了碱性蛋白酶酶解蛋白质所得产物的ACE 抑制活性。

2.2 三斑海马蛋白ACE抑制肽的分离和纯化

2.2.1 透析

酶解物和透析产物的IC50值见表1。

表1 酶解物和透析产物的IC50 值Table 1 The IC50 values of hydrolysate and dialysis product

试验中对酶解液进行透析处理，透析完成后冷冻干燥，并测定透析产物的ACE 抑制活性，相比酶解产物而言，透析产物具有更强的ACE 抑制活性，其IC50值为（0.44±0.26）mg/mL。以上结果表明，从三斑海马蛋白中分离纯化ACE 抑制肽是可行的。

2.2.2 Sephadex G-25 凝胶柱分离纯化

葡聚糖凝胶层析，又称分子排阻层析，是一种依据待分离物质的分子量大小进行分离的技术[21]。葡聚糖凝胶层析谱图见图1。

图1 葡聚糖凝胶层析谱图Fig.1 Elution profile of sephadex G-25 gel filtration chromatography

如图1 所示，透析产物经葡聚糖凝胶G-25 进一步分离纯化，得到3 个吸附峰，分别标记为F1，F2 和F3。将各组分配成1 mg/mL 溶液，并测定其ACE 抑制活性，如图2 所示。

图2 Sephadex G-25 分离各组分 ACE 抑制率（，n=3）Fig.2 The ACE-inhibiting activity of each fraction separated by sephadex G-25 gel filtration chromatography（，n=3）

组分F2 的ACE 抑制率最高，为（92.51± 0.49）%，IC50值为（0.11± 0.08）mg/mL。相比透析产物，其 ACE抑制活性明显增强，因此F2 用于进一步分离纯化。

2.2.3 反相高效液相色谱分离纯化

反相高效液相色谱是一种依据物质在固定相和流动相中分配系数、吸附能力等亲和能力的不同而将物质分离的色谱方法，具有分析速度快，分离效果好和灵敏度高等特点[21]。

试验中采用RP-HPLC 对葡聚糖G-25 凝胶分离得到的ACE 抑制活性最高组分F2 进一步分离纯化，如图3 所示。

F2 经反相高效液相色谱分离后，得到6 个具有ACE 抑制活性的峰，分别标记为 F2-1，F2-2，F2-3，F2-4，F2-5 和F2-6。由图3 可知，洗脱过程中产生了大量多肽，样品中存在的亲水性盐氯化钠可能影响了分离效果。分别测定各峰ACE 抑制活性，结果如图4所示。

图3 F2 经反相高效液相色谱纯化色谱图Fig.3 Purification of F2 by reversed-phase high performance liquid chromatography

图4 F2 经 RP-HPLC 分离各组分 ACE 抑制率（，n=3）Fig.4 The ACE-inhibiting activity of each fraction separated by RP-HPLC（，n=3）

组分 F2-4 的 ACE 抑制活性最强，0.5 mg/mL 的F2-4 的 ACE 抑制率为 （93.91 ± 2.18）%，IC50值为（0.005 7± 0.000 9）mg/mL。因此，F2-4 用于鉴定 ACE抑制肽分子量和氨基酸序列。

2.4 ACE抑制肽分子量和氨基酸序列的鉴定

试验通过电喷雾串联质谱（electrospray ionizationtandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）鉴定反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分离得到的ACE 抑制活性最强组分F2-4 的氨基酸序列和分子量，如图5 所示，多肽序列为 Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala（PAGPRGPA），分子量为 721.39 Da。

图5 F2-4 二级质谱图Fig.5 The secondary mass spectrum of F2-4

不同来源的海洋鱼类蛋白ACE 抑制肽见表2。

表2 不同来源的海洋鱼类蛋白ACE 抑制肽Table 2 Marine fish protein ACE inhibitory peptide from different resources

如表2 所示，近年来，人们从各种来源的海洋鱼类蛋白中分离出多种ACE 抑制肽。相比较而言，从三斑海马蛋白中分离得到的ACE 抑制肽具有相近或更强的ACE 抑制活性。

生物活性肽通常含有3～20 个氨基酸，低分子量的多肽比高分子量的多肽更有可能成为生物活性肽[22]。ACE 抑制剂通常含有1 或2 个分子功能受体，如锌结合配体，1 个氢链供体和羧基端基基团[24]。考虑到多肽结构和ACE 抑制活性的关系，通常，多肽C 末端有芳香族氨基酸，如脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸（Tyr），N 末端有脂肪族氨基酸，如缬氨酸（Val）或异亮氨酸（Ile），具有较强抑制活性[25]。Wu[26]等人通过计算分析提出ACE 抑制肽模型。他们认为，N 末端含有疏水性氨基酸残基，中间带有正电荷氨基酸，C 末端带有芳香族氨基酸残基的多肽显示更强的ACE 抑制活性。尽管ACE 抑制肽的结构活性关系还没完全建立，这些多肽具有一些共同的结构特征。实验成功从三斑海马蛋白中分离得到一种ACE 抑制肽，其多肽序列中含有三个脯氨酸（Pro）和两个丙氨酸（Ala），均为疏水性氨基酸，可能对ACE 抑制活性具有促进作用。

2.5 圆二色光谱分析

圆二色谱已经被广泛应用于研究蛋白质二级结构、动力学和折叠。二级结构，如α 螺旋，β 折叠和β转角在波长190 nm～260 nm 范围内有圆二色性[27]。α螺旋占优势的蛋白质在193 nm 附近有正椭圆率，222 nm和208 nm 处有负椭圆率。β 折叠占优势的蛋白质在218 nm 有负椭圆率，195 nm 有正椭圆率。无序蛋白质在高于210 nm 时有很低的椭圆率，195 nm 附近有负椭圆率[28]。多肽远紫外圆二色谱图如图6 所示。

图6 多肽远紫外圆二色谱图Fig.6 The far-UV circular dichroism spectrum of the purified peptide

圆二色谱图显示其在198 nm 附近有一个负峰，217 nm～225 nm 波长范围内有一个肩峰，无典型的α螺旋和β 折叠的结构特征。多肽二级结构预测见表3。

表3 多肽二级结构预测Table 3 The prediction of the purified peptide secondary structure

试验中测定了4 种不同的二级结构，分别为α 螺旋，β 折叠，β 转角和无规则卷曲。如表3 所示，多肽由6.0% α 螺旋，31.5% β 折叠，31.4% β 转角和 35.6%无规则卷曲组成。试验结果与Rhiannon[29]等的结果类似。

2.6 红外光谱分析

层析分离组分F2 的红外光谱图如图7 所示。

图7 层析分离组分F2 红外光谱图Fig.7 The FT-IR spectrum of F2

3 402.15 cm-1附近，强且宽的特征吸收峰是由OH 伸缩振动引起的，而2 963.48 cm-1处的吸收峰是由C-H 伸缩振动引起的。1 650.98 cm-1处最强的吸收峰是由酰胺基团中C=O 不对称伸缩振动引起的。1 544.17 cm-1处较强的吸收峰与酰胺基团中NH 伸缩振动有关。在1 401.98 cm-1处的吸收峰是由胺基基团中CN 伸缩振动引起的。上述结果表明F2 中存在肽键。

3 结论

本试验通过碱性蛋白酶酶解三斑海马蛋白制备含有ACE 抑制肽的酶解物，研究了酶解物、透析产物、葡聚糖凝胶分离各组分及反相高效液相色谱纯化各组分的ACE 抑制活性，并对反相液相色谱分离得到的ACE 抑制活性最强最分进行结构鉴定，成功从三斑海马蛋白中分离得到一种ACE 抑制肽：Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala（分子量：721.39 Da），其 IC50值为（0.005 7±0.000 9）mg/mL，具有较强的ACE 抑制活性。圆二色谱分析显示其无规则卷曲含量较高。本试验为三斑海马蛋白多肽的开发利用提供了一定的理论基础。