2株丁酸梭菌益生特性的比较研究

何光胜，付 彪，徐 诗，赵述淼，梁运祥，胡远亮，

(1.广东杨兴农业集团有限公司，广东 湛江 524100；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；3.湖北师范大学 生命科学学院食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是严格厌氧的革兰氏阳性内生芽胞杆菌，菌落形状不规则，呈奶白色圆形，菌体形态直线或弯曲状，中间部分略有突出，周围有鞭毛，能运动，端圆，细胞直径(0.6～1.2)×(3.0～7.0)μm[1].1933年日本科学家宫入近智首次发现丁酸梭菌，1935年成功从人体粪便中分离得到[2]。

研究表明丁酸梭菌生长代谢产生一系列短链脂肪酸，这不仅对肠道内的致病菌具有抑制作用，还能促进双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的生长，有益于肠道健康[3～4]。丁酸梭菌可用于调节肠道微生态平衡，防治动物细菌性腹泻，且丁酸梭菌产芽胞，与非芽胞类微生物相比其性能更加稳定，耐储存，展现良好的应用前景，因此相关研究备受关注[5]。丁梭梭菌的肠道耐受能力与益生特性是重要的评价指标。本文通过比较2株丁酸梭菌的特性，为益生菌的筛选与评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) M1、Q1，大肠杆菌(Escherichiacoli)K88和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。

梭菌增殖培养基(RCM培养基)：酵母浸膏3 g，牛肉浸膏10 g，胰蛋白胨 10 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化钠5 g，三水合乙酸钠3 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，0.5%美蓝0.2 mL，蒸馏水1 000 mL，配制固体培养基以1.5%～2.0%加入琼脂，调节pH至7.1 ± 0.1，115°C、20 min灭菌备用。

LB培养基：酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，配制固体培养基以1.5%～2.0%加入琼脂， 调pH至 7.2～7.4，121°C、15 min灭菌。

1.2 丁酸梭菌活化

将保藏的菌种分别接至RCM液体培养基中，37°C静置厌氧培养48 h，水浴80°C、10 min，取0.1 mL转接至9.9 mL RCM液体培养基试管中，37°C静置厌氧培养16 h.

1.3 生长曲线和pH曲线的测定

取25支装有9.9 mL RCM的液体培养基试管，分别吸取活化菌株0.1 mL，37°C厌氧培养。每隔2 h，分别测OD650值和pH值，每次取3支重复试管，以时间为横坐标绘制生长曲线和pH曲线。

1.4 耐人工胃液能力

配制人工胃液调至pH3.0，灭菌备用。取1 mL活化的菌液，离心洗涤芽胞悬液，接种至9 mL人工胃液中，37°C静置培养，每组3个重复，定期采样，用试管法检测活菌数量，计算存活率。

试管计数法：取1 mL丁酸梭菌发酵液，进行梯度稀释。18 mm的试管倒入15 mL灭菌的RCM半固体培养基(0.6%琼脂粉)，当温度降低到55°C左右，取100 μL稀释液，加入到半固体培养基中，混合均匀，并加入2～3 mL石蜡密封，培养37°C、16 h，取出计数。

1.5 耐猪胆盐能力

取1 mL活化的菌液，离心洗涤芽胞悬液接种于含0.1%、0.3%和0.5%猪胆盐的9 mL RCM液体培养基中，37°C静置培养，每组3个重复，3 h后分别用试管计数法检测活菌数量，计算存活率。

1.6 耐药性实验

分别取0.1 mL活化菌液接种至含抗生素的RCM培养基中，每组3个重复，置37°C厌氧培养24 h，观察生长情况。

1.7 肠道致病菌体外拮抗实验

致病菌活化：将猪大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌甘油管分别转接于LB斜面培养基，置于37°C培养48 h后，取一环菌接种于9.9 mL RCM液体培养基中，厌氧静置培养16 h.

单独培养：取13支装有9.9 mL的RCM液体培养基，取0.1 mL活化好的致病菌液接种到试管中，置于37°C静置培养，定期采样，测定活菌数和pH值。

丁酸梭菌和致病菌混合培养：取13只装有9.8 mL RCM液体培养基试管，各取0.1 mL活化好的丁酸梭菌和致病菌菌液接种到试管中，置于37°C静止厌氧培养，定期采样，测定活菌数和pH值，并与单独培养时的测量值对比。

致病菌计数采用梯度稀释平板计数法，选用LB平板， 37°C培养48 h，进行计数。由于丁酸梭菌是严格厌氧菌，在有氧情况下无法长出，因此计算结果为致病菌菌数。

2 结果与分析

2.1 生长曲线和pH曲线的测定

由图1可知，2株丁酸梭菌的生长趋势大致相同，均在0～10 h生长平缓，处于迟缓期，12～16 h生长旺盛，吸光值快速上升，处于对数期，16 h后生物量趋于平稳，处于稳定期。M1的最终生物量比Q1略高；2株丁酸梭菌的pH变化趋势也大致相同，最终pH均在4.5左右，这是由于丁酸梭菌在发酵过程中产生丁酸和乙酸等有机酸，导致对数期pH迅速下降。

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图1 丁酸梭菌M1(A)和Q1(B)生长曲线和pH曲线

2.2 耐人工胃液能力

丁酸梭菌进入肠道内发挥作用首先必须耐受低pH值的胃液环境，人体胃液pH通常在3.0左右，食物在胃内停留的时间为1～3 h.由表1可以看到，2株菌对pH 3.0的人工胃液的耐受能力有一定差别，将0 h的丁酸梭菌活菌数定义为100%，3 h后菌株M1存活率仍在80%以上，菌株Q1存活率仅为21.4%.

表1 丁酸梭菌对pH 3.0人工胃液的耐受性

2.3 耐猪胆盐能力

丁酸梭菌通过胃液进入小肠，它能在肠道中存活并发挥作用，必须具有一定的胆盐耐受能力，人体肠道胆盐浓度一般为0.03%～0.3%.从表2知，猪胆盐浓度越高，丁酸梭菌存活率越低， 0.3%的猪胆盐浓度下，存活率均为10%以上，表明这2株菌对猪胆盐的耐受能力良好，菌株M1比菌株Q1的胆盐耐受能力强。

表2 丁酸梭菌对不同猪胆盐浓度的耐受性

2.4 耐药性

由表3可知，丁酸梭菌Q1和M1对常见抗生素的耐受性大致相同，均对氨苄青霉素敏感，对红霉素耐受能力较差，对氯霉素、庆大霉素和卡那霉素耐受能力较强。

表3 丁酸梭菌对抗生素耐受性

注：“+++”生长良好，“++”生长一般，“+”生长，“-”不生长。

2.5 对肠道致病菌体外拮抗能力

分别将2菌株与金黄色葡萄球菌混合培养， 16 h后金黄色葡萄球菌数量明显低于单独培养，数量差距达到2个数量级，说明这两个菌株都能抑制金黄色葡萄球菌的生长(图2)。金黄色葡萄球菌在生长过程中不产酸性物质，而丁酸梭菌产丁酸和乙酸等有机酸，这使得混合培养时的pH值降低，从而抑制金黄色葡萄球菌的生长。分别将2菌株与大肠杆菌K88混合培养，24 h后大肠杆菌K88数量明显低于单独培养，数量差距达到2个数量级，说明这2个菌株都能显著抑制大肠杆菌K88的生长由(图3)。

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图2 丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

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图3 丁酸梭菌对大肠杆菌K88的拮抗作用

3 讨论

本文对2株丁酸梭菌Q1和M1的益生特性进行了分析，研究发现2株菌生长性能和抗药性相近，但耐胃酸、耐胆盐能力有一定的差别。丁酸梭菌M1与Q1在pH 3.0人工模拟胃液中保持3 h，存活率分别为87.6%、21.4%，在0.5%猪胆盐浓度培养基中保持3 h，存活率分别为11.0%、8.1%.丁酸梭菌B1在pH 2.0的人工模拟胃液中3 h后存活率在90%以上，在0.5%猪胆盐浓度培养基中3 h后存活率在30%以上[6]。丁酸梭菌ZJUCB在pH 2.0的人工模拟胃液中3 h后存活率为25%左右，在0.5%猪胆盐浓度培养基中3 h后存活率在60%以上[7]。这些结果说明，不同的丁酸梭菌，耐胃酸、耐胆盐能力有较大差别，即使被鉴定是丁酸梭菌，也不一定具备饲料添加剂应用前景，耐胃酸和耐胆盐能力应作为评价饲用丁酸梭菌的重要指标。

研究发现，2株丁酸梭菌都能够显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌K88的生长，与单独培养病原菌相比，混合培养时金黄色葡萄球菌与大肠杆菌K88数量明显下降。曹广添等[8]体外研究表明，丁酸梭菌对大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌具有抑制作用，对乳酸杆菌和双歧杆菌有促进作用。目前，丁酸梭菌抑制某些致病菌的作用机理至今仍不明确，大部分学者认为是丁酸梭菌代谢产生的酸性物质降低了pH，从而抑制病原微生物的生长[9]。丁酸梭菌抑制病原菌生长及作用机理，应通过动物实验进行深入研究。

本文通过比较2株丁酸梭菌的益生特性，发现不同菌株性质差别较大，丁酸梭菌M1具有更好的应用前景。本实验为益生菌的筛选和评价提供参考。