侧柏果实总黄酮的提取工艺研究

倪 明，吴高泉，何涓源，李煜林

(1.湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002；2.湖北师范大学 生物学国家级实验示范中心，湖北 黄石 435002；3.湖北师范大学 文理学院，湖北 黄石 435002 )

0 引言

侧柏别名崖柏、香柏、松蟠，一般生长在石灰岩山地或潮湿肥饶的地方，为中国特产，除青海、新疆外，中国各地均有种植。黄酮类化合物是一类普遍存在于植物界的次生代谢产物，其功效及成分来源尤为多样[1]，药物的毒副作用也少，并且拥有预防癌症、消除自由基、降低血糖和抵抗炎症等药理活性[2]。目前，侧柏叶的总黄酮提取工艺研究很多[3～5]，但与侧柏果实总黄酮提取有关联的研究文献鲜见报道。为了更好地开发利用侧柏，我们决定开展侧柏果实黄酮提取工艺研究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 侧柏果实摘自于湖北师范大学。

1.1.2 仪器设备 试验室粉碎磨(JFSD-70型，上海嘉定粮油仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-4型，金坛市医疗仪器厂)；电子分析天平(BSA124S型，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；循环水式真空泵(SHZ-D型，巩义市英峪予华仪器厂)；电热恒温干燥箱(SKG-02型，黄石恒丰医疗器械有限公司)；冰箱(BCD-196KTX型，青岛海尔股份有限公司)；紫外可见分光光度计(UV754N型，上海楚定分析仪器有限公司)。

1.1.3 试验试剂 硝酸铝(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；芦丁标准品(上海金穗生物科技有限公司)；氢氧化钠(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；亚硝酸钠(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；石油醚(60～90℃)(分析纯，上海国药试剂集团)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的预处理 采集新鲜的侧柏果实，蒸馏水清洗，自然风干后剪成细小碎块，放入60℃烘箱中烘干并研磨，过60目筛之后再放入烘箱中烘干。将侧柏果实干燥粉末装入自制滤纸筒，密封后置于索氏提取器中，加入适量石油醚回流脱脂、脱色，直至提取管内溶液无色为止。将脱色后的侧柏果实粉末烘干至恒重后，置于干燥器中备用。

1.2.2 标准曲线的制作 芦丁在烘箱120℃中烘至恒重，冷却后精确称取0.025 g，用浓度为95%的乙醇溶解所称取芦丁，充分溶解后将之转移到100 mL容量瓶中定容到刻度线，这样就可以得到质量浓度为0.25 mg/mL的芦丁标准溶液。精密吸取芦丁标准品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分别加入7只25 mL比色管中，依次加入5%的NaNO2试剂1 mL，摇晃反应6 min，依次加入10%的Al(NO3)3试剂1 mL，摇晃反应6 min，依次加入10%的NaOH试剂10 mL，然后用95%的乙醇溶液定容到25 mL，充分摇晃，静置15 min .以空白组作为对照，在504 nm处用紫外分光光度计测定各组吸光值(A)[6].

1.2.3 样品总黄酮提取及含量的测定 称取0.500 g预处理后的侧柏果实粉置于50 mL圆底烧瓶中，在水浴锅中使用乙醇溶液浸提，在一定温度下水浴回流一段时间后，进行减压抽滤，滤饼用适量乙醇溶液洗涤三次，合并滤液定容，得到样液。

样液测定总黄酮含量：取样液1 mL置于25 mL比色管中，加5%的NaNO2试剂1 mL，摇匀反应6 min，再加10%的Al(NO3)3试剂1 mL，摇匀反应6 min，加10%的NaOH试剂10 mL，摇匀，用浓度为95%的乙醇试剂定容到25 mL，静置15 min后，以空白试剂为对照，于504 nm用紫外分光光度计测定其吸光值，利用标准曲线方程得到总黄酮含量。然后即可计算总黄酮得率：

总黄酮得率 = (C×V)×100%/(M×1000)

式中：C——样品液的质量浓度(mg/mL)；

V——总提取液体积(mL)；

M——预处理后的侧柏果实粉质量(g).

1.2.4 侧柏果实总黄酮提取的正交试验设计 在预试验结果的基础上，以总黄酮得率为最终评价标准，确定料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取温度(C)、提取时间(D)的提取最优条件，每个因素确定三个水平进行正交试验设计。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

按照1.2.3的方法测出吸光度值后，以吸光度为纵坐标，以芦丁含量(mg)为横坐标，制图(如图1所示)，得到标准曲线方程：y=0.4896x-0.0004，R2= 0.9997.

图1 标准曲线

2.2 侧柏果实总黄酮提取的正交试验结果及分析

根据预试验，确定提取时间、乙醇体积分数、提取温度和料液比的因素水平(见表1)，根据表1利用正交设计软件设计正交试验，通过试验得到侧柏果实总黄酮的得率(见表2)。

表1 侧柏果实总黄酮提取的正交试验因素水平设计表

由表2极差R分析可得到，这四种因素对侧柏果实总黄酮得率的影响排序为：提取温度>乙醇体积分数>提取时间>料液比。由表2可得理论最优组合为A3B2C3D3，对该理论最优组合进行验证试验，得到的得率10.71%，结果表明这个条件下得率最高。为了验证试验重复性，在最佳提取条件下，反复进行三次验证试验，依次得到侧柏果实黄总酮得率为10.43%、10.31%、10.18%，从而得出侧柏果实总黄酮的平均得率为10.30%.

表2 侧柏果实总黄酮提取工艺正交试验表

3 结论

本试验以乙醇溶液为溶剂，以侧柏果实总黄酮得率为考察对象，通过对温度、料液比、时间和乙醇体积分数进行单因素试验和正交试验，得到侧柏果实总黄酮最佳提取工艺为：料液比为1∶70，乙醇体积分数为60%，提取温度为100℃，提取时间为8 h，在此条件下得率达到10.71%.