青钱柳黄酮类成分不同提取方法及药理活性研究

李俊秀 廖夏云,2 赵立春,2﹡ 杨涛,2

1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200

青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaja ] 别名青钱李、麻柳、摇钱树、山化树、一串钱、山麻柳、甜茶树等，系胡桃科、青钱柳属植物[1]。分布于我国南方多省地海拔420～2500m的山区、溪谷、石灰岩山地[2]。《中国中药资源志要》中记载：青钱柳叶和皮均可入药，具有止痛、清热解毒等功效，用于治疗顽癣[3]。高血糖症现已成为人类的第二大杀手，而由青钱柳芽叶制成的茶在“三高症”人群的防治中有良好效果。青钱柳茶也成为我国首个被美国FDA认证的抗高血糖保健茶[4]。研究者对青钱柳化学成分进行提取、分离和纯化发现：青钱柳提取物除含丰富的矿质元素外，其化学成分主要有黄酮类、多糖、甾体类、内酯、皂苷、氨基酸等，尤以黄酮类化合物含量较为丰富[5-7]。动物实验及临床实验研究表明：青钱柳提取物有多种保健功能，能降血糖、降血压、降血脂、增强细胞免疫、抗氧化、防衰老、抗癌等[8-13]。黄酮化合物在青钱柳提取物药效成分中占一定比例。植物黄酮的诸多功效应用在食品、化妆品、医药等领域有其独特的优势，因此，对黄酮类化合物的研究对于青钱柳药用价值的开发和利用具有重要意义。笔者通过检索相关文献资料，综述青钱柳黄酮的成分组成、测定方法、提取方法以及活性研究进展，为青钱柳黄酮的进一步研究及开发应用提供参考依据。

1 青钱柳黄酮类化学成分

黄酮类化合物是青钱柳的主要化学和活性成分之一。研究者利用各种色谱技术对青钱柳化学成分分离和纯化，并通过物理化学和波谱等鉴定技术手段，目前已鉴定并报道的青钱柳黄酮单体达40多种，主要为黄酮醇及其苷类结构，与苷元结合的糖有葡萄糖、甘露糖和鼠李糖等。结果见表1、图1。

表1 已鉴定的青钱柳黄酮单体

图1 化合物1～46的结构

2 青钱柳黄酮类成分的测定

2.1 紫外可见分光光度法 黄酮类化合物因结构中有A环(苯甲酰基系统)和B环(桂皮酰基系统)两个交叉共轭体系，分别在240～280 nm(带Ⅰ)和300～400 nm(带Ⅱ)之间产生两个紫外吸收谱带。因黄酮苯环上多有取代酚羟基，碱性条件下两个紫外吸收谱带可出现红移。利用此光谱性质，采用分光光度法在其紫外波谱的λmax处可测定总黄酮含量。目前文献报道的运用紫外分光 光度法测定青钱柳总黄酮含量，多以芦丁为对照品，以三氯化铝为显色剂[28-29]，或以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系为显色剂[30]，显色后用分光光度计在一定波长处测定。值得注意的是，一些黄酮类化合物(异黄酮、黄烷酮、儿茶素等)在可见光区与AlCl3作用不显色可能导致测定结果偏小；而以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色体系时，在500nm波长处某些黄酮类成分(黄芩素、橙皮苷、槲皮素、山奈酚等)吸收很弱，但某些非黄酮类成分(绿原酸、原儿茶酸等)有最大吸收，使硝酸铝显色法专属性不强，准确性较差。李富民等[31]曾以芦丁和槲皮素为对照品，对三氯化铝显色法(测定波长410 nm)和硝酸铝显色法(测定波长500nm)进行反复试验比较，结果得出AlCl3显色法是比Al(NO3)3显色法更精确、快速的含量测定方法，更适合于青钱柳总黄酮含量测定的结论。

2.2 高效液相色谱法 高效液相色谱法(HPLC)具有分离效果好、专属性强、重复性好、准确度高、分离分析速度快、仪器自动化程度高等特点，广泛应用于天然产物尤其是单体化合物的含量分析。将样品溶液注入HPLC系统进行在线分离和检测，利用外标法、内标法、面积归一化法等方法，测定指标成分的含量。对多组分的含量测定则需利用校正因子或转换系数进行数据处理，换算出样品中总黄酮的含量。表2列出了近年利用HPLC法分析青钱柳黄酮含量的相关研究，可见HPLC法为测定青钱柳黄酮成分含量、建立青钱柳指纹图谱、筛选药用青钱柳优良产地、确定青钱柳的最佳采收期，对青钱柳进行质量评价和控制等提供了快速、可靠的分析手段。

表2 HPLC法分析青钱柳黄酮的相关研究

续表2 表2 HPLC法分析青钱柳黄酮的相关研究

3 青钱柳黄酮类成分的提取

3.1 溶剂提取法 溶剂提取法中水提法适用亲水性黄酮类化合物，如水溶性黄酮苷类的提取。因水提法的提取效率低、提取物中极性杂质多、分离提纯困难而不常用。碱提取酸沉淀法应用在含弱酸性酚羟基的黄酮类化合物的提取上比起醇提法更具安全、便捷、成本低等优势，其提取基本流程：青钱柳样品→加入适量硼砂、碱性饱和石灰水提取→提取液PH值调至酸性→提取液加入乙酸乙酯、正丁醇分别萃取→萃取液合并，旋转蒸干→青钱柳总黄酮。得率与固液比、碱提取液PH值、硼砂用量、提取时间、酸沉PH值等因素有关，可采用正交实验设计优化影响因素的工艺参数[36]。

有机溶剂提取法是提取黄酮类成分的经典方法，比较容易实现工业化生产，常用的有机溶剂为乙醇。邓佑林等[37]采用索氏提取器加热回流提取青钱柳总黄酮，比较了不同浓度乙醇和水为溶剂下的提取效果，结果以水为溶剂时提到的黄酮含量只有乙醇的一半，证明乙醇对青钱柳黄酮的溶出效率高。乙醇提取具有无毒、提高黄酮类成分溶解性等优点，但提取时间长、溶剂耗量较大、提取液需进一步处理。

3.2 超声辅助提取法 超声辅助提取具有操作简单，耗能少，提取效率高等优点，其应用是建立在溶剂提取的基础上，因超声波可加快青钱柳细胞壁的破裂，减少提取时间，从而提高黄酮提取效率；同时该方法提取时不需要较高的温度，可避免黄酮类化合物结构遭到破坏，被广泛应用。作为一种常用的中药活性成分提取方法，超声功率、超声时间、超声温度、提取溶剂、用量等均能影响青钱柳总黄酮提取率，不同因素对其提取率的影响作用大小不尽相同。吴茹[38]采用响应面法优化了影响乙醇超声提取青钱柳总黄酮的各因素工艺参数，得到提取率的影响因素作用大小依次为：超声功率、乙醇浓度、提取时间、料液比。优化的工艺参数为：乙醇浓度48%；料液比1∶34g·mL-1；超声功率162W；超声时间41min。该条件下提取率达8.427%。

3.3 微波辅助提取法 微波提取法是利用微波能量加快药物分子热运动，从而加速破坏细胞壁使有效成分更快提取出来的方法。杨武英等[39]研究了微波辅助法提取青钱柳叶总黄酮，数据分析表明，微波功率是影响微波辅助提取青钱柳叶总黄酮得率的最主要因素。最佳提取工艺参数为：40%乙醇；料液比1∶40g·mL；微波功率2100W；提取时间25min。此条件下，青钱柳叶总黄酮提取率为5.60%。微波法作前处理，比一般方法溶剂耗量少，时间短，得率高。

3.4 酶解法 利用酶对大分子物质的分解作用，在原料中加入合适的酶使细胞壁和间质中的纤维素、果胶等大分子物质完全分解，黄酮物质被充分释放出来后，再对其进行提取，能大大提高提取效率。柯福星[40]采用酶法-超声波辅助提取青钱柳叶中总黄酮，根据单因素试验和正交试验数据分析，得出最佳提取工艺为：0.4g.100mL-1的木瓜蛋白酶水溶液作为提取剂；温度58℃；超声波功率400W；提取时间70min。柳旭光等[41]以纤维素酶解法提取青钱柳黄酮，运用响应面法优化影响因素参数，在酶解时间32.28min；温度41℃；加酶量0.57%；缓冲液pH 6.37的条件下提取效率最佳，青钱柳总黄酮提取得率达9.227%。酶法与别的提取方法联用，提取量显著高且活性成分保存好。

3.5 其他提取方法 深共晶溶剂是一种新型的离子溶剂，具有低廉、易合成、安全性高、环保等优点。其显著的物理化学和生物降解性能使它们成为传统有机溶剂的替代品。ShangXC等[42]研究超声辅助-深共晶溶剂萃取法(UAE-DES)提取青钱柳叶中黄酮类化合物，试验了九种基于两种或三种组分的DES体系，筛选出合适青钱柳黄酮化合物提取的工艺，DES可作为生物活性化合物的可持续提取介质，该法是一种较好的从青钱柳叶中选择性提取黄酮类化合物的方法。

微生物发酵技术是利用微生物生长过程中产生的代谢物酶，分解破环植物细胞组织结构，使有效成分较大程度的溶出，该法具有提取物稳定、纯度高、反应条件温和、有机溶剂使用量少等优点。将微生物发酵技术应用到青钱柳黄酮提取(工艺流程：青钱柳叶干燥、粉碎→酶解→高温灭菌→接种→发酵提取→过滤→青钱柳黄酮)，得率远高于超声提取和有机溶剂提取[43]，是一种经济有效、快速提取的方法，大大提高青钱柳黄酮的提取率和原料利用率。

将近几年选择不同提取方法得到的青钱柳黄酮类物质最佳提取工艺条件列于表3。由于原料的产地、处理方法的不同，各提取方法提取的青钱柳黄酮得率存在一定差异，提取方法的优越性仅根据黄酮得率高低来判断意义不大，还应从黄酮的纯度和活性方面综合考虑，建议根据研究的目的、要求、条件及环境选择适宜的提取方法。

表3 青钱柳总黄酮不同提取方法研究

4 青钱柳黄酮类成分活性研究

黄酮类化合物是青钱柳的 主要活性成分之一。对青钱柳黄酮生理活性及作用的研究如下(表4)。

4.1 降血糖 糖尿病治疗机制主要有促进胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性、减轻胰岛素抵抗、抑制α糖苷酶等，青钱柳黄酮降血糖机理的研究也主要从调节血糖水平、改善胰岛细胞功能、改善胰岛素抵抗和免疫调节等方面进行。

链脲佐菌素对胰岛β细胞有选择性破坏作用，导致胰岛素分泌不足。对链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠用青钱柳总黄酮连续给药，可降低糖尿病大鼠空腹血糖、提高血胰岛素水平、减缓体重下降，并且能改善其肝肾功能，推测降血糖的原因可能是糖尿病大鼠中残存的胰岛细胞被青钱柳总黄酮成分激活有关[46]。前脂肪细胞分化能使多种相关转录因子的表达发生变化，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，提高脂肪组织细胞的敏感性；HepG2细胞具有表达胰岛素样生长因子和胰岛素受体的代谢反应。它们对胰岛素抵抗是引起糖脂代谢紊乱的重要原因。对3T3-L1前脂肪细胞胰岛素抵抗模型和HepG2细胞胰岛素抵抗模型的研究结果表明：青钱柳总黄酮能明显促进3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化，改善胰岛素抵抗作用，提高胰岛素抵抗的脂肪细胞和HepG2细胞葡萄糖摄取量[47-48]。通过体外α-葡萄糖苷酶抑制实验，揭示青钱柳黄酮成分的降血糖机制还与抑制α-葡萄糖苷酶活性，延缓餐后血糖升高有关[49]。

4.3 抗菌活性 黄酮类化合物属于酚类衍生物，pH偏酸性，能让菌类蛋白质凝固或变性，使其细胞壁及细胞膜被破坏，导致微生物产生功能性障碍，生长被抑制或菌体死亡。体外抗菌实验常用方法有稀释法、滤纸片法、打洞法、管蝶法等，滤纸片法操作简单、结果直观、重复性好、成本低，是最常用的方法。采用滤纸片扩散法研究青钱柳黄酮对常见的腐败菌种(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等)的抑菌效果，通过测定抑菌圈的各项指标，冯宗帅[50]的研究结果显示对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度MBC分别为25 mg/mL、28 mg/mL；37 mg/mL、40 mg/mL和40 mg/mL、40 mg/mL。Lei X等[32]的实验研究显示青钱柳黄酮浓度高于40 mg/mL时，抑菌和杀菌效果好，纯化后的青钱柳叶总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强，其次是沙门氏菌，对大肠杆菌的抑制能力最弱。

4.4 抗急性肝损伤 肝损伤是各种肝脏疾病共同的病理环节，急性肝损伤(ALF)的特征是突然出现肝功能障碍、凝血障碍和脑病。目前已知多种外源性药物可引起肝毒性和急性肝衰竭，四氯化碳(CCl4)和D-半乳糖胺(D-GalN)是常用的诱发化学性肝损伤模型的化学药物，模型病理特征稳定可靠，在病理学改变与生物化学变化方面与人化学性肝损伤相似。Xie JH等[51]对四氯化碳导致的小鼠急性肝损伤进行了研究，发现用青钱柳黄酮处理能较好地降低ALF小鼠血清ALT和AST水平(P<0.01)，同时降低肝匀浆中丙二醛(MDA)的含量，显著升高超氧化物歧化酶(SOD)活力和总抗氧化能力(T-AOC)。对脂多糖和D-半乳糖胺((LPS/D-GalN)联合诱导的急性肝衰竭小鼠给予青钱柳黄酮处理(100 mg / kg、200 mg / kg、400 mg / kg)，均能有效提高ALF小鼠的存活率[52]，青钱柳黄酮通过抑制ALT和AST水平，减轻氧化应激，改善肝形态，降低小鼠肝细胞凋亡，有效预防和治疗CCl4和D-GalN诱导的ALF。

4.5 调节肠道微生物 黄酮类化合物生物利用度较低，青钱柳总黄酮口服后大部分留在大肠内累积，对肠道微生物具有调控作用，影响某些代谢途径，对某些疾病具有潜在的治疗作用，有助于改善人类健康。肥胖是一个严重的全球性健康问题，是许多危及生命的疾病发生或发展的危险因素，肥胖人群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例(F/B)高于瘦人，通过对高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠给予青钱柳总黄酮(CPF)治疗8周后，发现HFD组体重明显大于HFD-CPF组，F/B值有明显下降(P<0.05)，表明青钱柳黄酮对高脂饮食诱导的肥胖具有调节保护作用[53]。此外，通过体外厌氧粪样混合培养实验研究[54]，青钱柳黄酮能改变肠道内菌体的组成，增加有益菌群双歧杆菌、乳酸菌的繁殖，并抑制拟杆菌、梭状菌的生长，而对总体菌群数量基本没有影响。青钱柳黄酮具有益生元活性，可能与其发挥调节代谢活动中产生的氧化应激的抗氧化作用，从而为肠道有益菌群提供了更有利的生长和繁殖环境有关。

表4 青钱柳黄酮的生物活性

续表4 表4 青钱柳黄酮的生物活性

5 总结与展望

青钱柳在治疗“三高症”、抗氧化等方面有显著的效果，具有很高的开发利用价值。由青钱柳叶加工成的茶具有良好的保健功效被广泛认可，同其他品种茶叶相比，青钱柳叶中黄酮类成分的含量较高。目前，研究者对青钱柳化学成分的提取分离及活性研究方面已取得不错的进展，对青钱柳的进一步深入研究、原材料质量评价、相关产品开发及资源合理利用等方面提供了丰富的理论依据。但关于青钱柳黄酮类成分的研究仍不足：

①关于青钱柳黄酮提取的研究较多，而纯化方面的研究较少，且研究不够系统，仅停留在实验阶段，今后可学习借鉴其他天然产物中黄酮的提取纯化技术，创新其提取纯化工艺，以达到高效、快速、低成本、利于规模化生产的目的。

②目前在青钱柳黄酮类成分药理活性和作用机制的研究方面，多是对其总提取物和总成分进行研究，而对单体尤其是新分离出的单体化合物的研究不足，应进一步深入开展单体的药效和构效关系的研究，以便阐明青钱柳黄酮发挥药理作用的具体成分和作用机理。

③青钱柳黄酮类化合物主要以糖苷的形式存在，不同黄酮母核与糖元结合的种类、数量、结合位点和方式都可能影响其药理活性；另外，青钱柳黄酮类单体成分仍有很多没有被分离鉴定出来，故在未来的研究中，应加速青钱柳黄酮单体的精细分离和结构解析，并根据其结构特点进行分类汇总、对比活性研究，对不断阐明和挖掘其潜在的构效关系，寻找具有针对性和高效性的黄酮类先导化合物以及进行结构改造和优化均有重要意义。

④青钱柳黄酮类成分含量较高，但目前已开发的产品在市场上仅以茶叶、饲料为主，青钱柳黄酮的诸多功效未能得到充分开发和利用，相信随着研究的不断深入推进，更多疗效明确的青钱柳黄酮保健产品和药品将被开发出来，在发展人民的健康事业和发展地方经济上青钱柳有广阔的前景。