接触蛋白-1在原发性肺鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

2020-05-07张瑞婕戢福云钱桂生余世龙王导新

中华肺部疾病杂志(电子版) 2020年2期

张瑞婕戢福云钱桂生余世龙王导新

肺癌是全球癌症病死率最高的恶性肿瘤[1]。流行病学资料表明，85%肺癌是由非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组成，包括鳞状细胞癌、腺癌及大细胞癌，其中鳞状细胞癌是仅次于腺癌的常见NSCLC[2]。转移和侵袭是恶性肿瘤的常见生物学特性，是导致癌症患者预后不良或死亡的最主要原因[3]。

接触蛋白-1(contactin-1, CNTN-1)是免疫球蛋白超级家族接触蛋白亚组的一员，最早发现其参与神经系统的发育[4]。近年来发现，CNTN-1能介导多种肿瘤细胞的转移和淋巴管的生成，如口腔鳞状细胞癌、胃癌、食道癌、肺腺癌、乳腺癌等[5-10]。然而，CNTN-1基因在肺鳞状细胞癌中是否表达及其表达是否与肺鳞癌细胞侵袭和转移相关尚未报道。本研究通过免疫组化的方法检测CNTN-1在原发性肺鳞状细胞癌患者和人正常肺泡上皮组织中的表达情况，进而探讨CNTN-1表达与患者临床病理参数的关系。

资料与方法

一、临床资料

选取2018年6月至2018年12月经陆军军医大学第二附属医院病理科确诊为原发性肺鳞状细胞癌手术标本石蜡切片63例及人正常肺泡上皮组织石蜡标本20例，所有患者术前均未接受化疗或放疗。63例原发性肺鳞状细胞癌患者中，男性患者54例，女性7例。患者年龄分布为38～75岁，中位年龄59岁。按2018年美国国立综合癌症网络发布的指南[11]对入选肺鳞状细胞癌患者行TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。术前淋巴结转移阳性18例，阴性21例；术后淋巴结转移阳性8例，阴性20例，见表1。

二、主要仪器，试剂及来源

无水乙醇、二甲苯及30%过氧化氢溶液均购于我院中心实验室试剂库；兔抗人CNTN-1多克隆抗体购于美国Abcam公司；柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购于北京中杉生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购于迈新生物公司；苏木素染液、中性树胶购于北京鼎国生物技术有限公司；光学显微镜、恒温水浴箱、染缸、高压锅均由陆军军医大学附属第二医院中心实验室提供。

三、实验方法

对石蜡样本进行连续切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、PBS缓冲液冲洗3次后，采用柠檬酸盐高压法进行抗原修复；PBS缓冲液冲洗3次，用3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，5%牛血清蛋白中封闭非特异性染色位点，加一抗稀释液在4 ℃条件下孵育过夜；PBS缓冲液冲洗3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液在37 ℃条件下孵育1 h；PBS缓冲液冲洗3次，依次经DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、蒸馏水反蓝及封片后，在光学显微镜下观察。CNTN-1的表达水平由两位病理科专家在未知临床病理资料情况下读取结果并评定，评定标准：以细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为CNTN-1的阳性染色，高倍镜下(×200)随机选取5个视野，根据阳性细胞数百分比及染色强度分别计分并判定染色结果，染色强度等级评分如下：无染色(0)，淡染色(1)，棕黄色(2)，棕褐色(3)。阳性细胞百分比计数如下：0(0%)，1(1～25%)，2(26～50%)，3 (>50%)。根据染色强度和阳性细胞百分比计算HScore评分(HScore=阳性细胞百分比X(染色强度+1))[12]。

表1 CNTN-1的表达与肺鳞癌患者临床病理参数之间的相关性 [n(%)]

注：a：χ2检验或Fisher确切概率法；b：患者吸烟年包数的中位数作为界限值；c：资料分析时已排除无肿瘤组织切片；d：患者术后应用顺铂或卡铂为基础的辅助化疗

四、统计学方法

选用SPSS13.0软件包进行统计处理。所有计数资料均以例数和构成比(%)表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法进行组间差异比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、 CNTN-1在正常肺泡上皮组织和原发性肺鳞状细胞癌组织中的表达

免疫组化结果显示，CNTN-1在原发性肺鳞状细胞癌组织中广泛表达(图1A-1F)，在正常肺泡上皮细胞中不表达(图1G和1H)。由图1可见，CNTN-1的表达定位在细胞膜和细胞浆。63例原发性肺鳞癌组织标本中，阳性表达35例，阴性表达26例，2例因石蜡切片上的标本脱落而无癌组织，阳性率为55.56%(35/63)。其中，阳性中低表达13例(20.63%，13/35)，中表达19例(30.16%，19/35)，高表达3例(4.76%，3/35)。免疫组织化学半定量分析结果表明，CNTN-1在肺鳞癌组织中的表达显著高于正常肺泡上皮组织。

二、 CNTN-1表达与原发性肺鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系

χ2检验或Fisher精确检验统计结果显示，CNTN-1的阳性表达与原发性肺鳞癌患者吸烟(P=0.023)及术前淋巴结侵袭显著相关(P=0.01，表1)，与性别、年龄、肿瘤组织的分化级别、分期及肿瘤大小无关，而其差异表达与患者的所有临床病理参数均无相关性，见表2。

讨论

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管近年来总体发病率有所下降，但仍然是癌症患者死亡率最高的恶性肿瘤[13]。肺鳞状细胞癌是NSCLC的第二常见病理类型[14]，肿瘤细胞的迁移和侵袭是导致其预后不良甚至死亡的重要因素[15]。CNTN-1是免疫球蛋白超级家族接触蛋白亚组的一员。CNTN-1最初是在测定植物凝血素结合糖蛋白Gp135的氨基酸序列时发现的[4]。随后的研究发现，该蛋白是一个糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol, GPI)锚定的神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)，在各种神经组织中差异表达，参与神经系统的发育和小脑形态的发生等[16]，而CNTN-1突变则可造成致死性、先天性肌病[17]。CNTN-1在神经系统发育中的主要功能是促进神经轴突的推进导向作用[18-19]。CNTN-1在正常肺上皮细胞中没有表达。2006年，CNTN-1的上调表达被意外发现与肺腺癌细胞的侵袭和转移密切相关。体外采用siRNA沉默CNTN-1表达后，肺腺癌细胞的侵袭、迁移及黏附均受到抑制，并且，siRNA沉默组移植瘤重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, SCID)小鼠不仅在移植瘤、肺内转移结节大小上显著性小于对照组，并且在生存时间上也显著性优于对照组[5]。CNTN-1的上述生物学效应是其作为VEGF-C/Flt-4轴的下游效应分子而发挥作用的[20]。后续的研究进一步证实，CNTN-1上调表达不仅可增强肺腺癌侵袭性[21]，并可促进食道癌的发展和胃癌的淋巴浸润[6, 22-24]。

目前关于肺鳞状细胞癌组织中CNTN-1表达情况及其与患者临床病理参数之间的关系，在国内外尚未见相关报道。本研究通过采用免疫组织化学技术分别检测了63例原发性肺鳞癌组织和20例正常肺泡上皮组织中CNTN-1表达情况，研究发现，CNTN-1在正常肺泡上皮细胞中不表达，但在原发性肺鳞癌中广泛表达，这提示CNTN-1可能参与肺鳞癌发生发展的病理过程，但具体的调控机制需要进一步的实验研究。