900 MHz微波辐射不同时点暴露对雄性大鼠血浆激素水平昼夜节律的影响*

赵华，宗春燕，周振，曹毅

(贵州医科大学 公共卫生学院环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

睾丸是对微波辐射和电磁脉冲敏感的器官之一[1]。移动电话作为当今社会主要的通信工具，其对生殖系统的影响是现今研究的热点之一，有学者研究了微波辐射对睾丸组织、精子形态及数量的影响[2-5]，本课题前期研究证实了雄性SD大鼠血浆睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)和褪黑素(melatonin，Mel)存在明显昼夜节律，在大鼠自发活动的峰值或谷值时点给予 900 MHz 2 000 μW/cm2微波辐射能够影响大鼠血浆激素水平的昼夜节律性[6]。为维持机体正常功能，血浆激素水平稳定是非常重要的，本研究以血浆Mel具有明显昼夜节律性的大鼠为模型，探讨微波辐射影响昼夜节律的敏感时间，检测不同时点微波辐射对大鼠血浆Mel和T水平的影响程度，为研究微波辐射对生殖系统的影响和防护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

PMM8053A场强仪(意大利PMM公司)，自发活动视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司)。电磁辐射系统：GTEM室(长5.67 m、宽2.83 m、高2.07 m，型号DN6313A，苏州大学研制)，功率放大器(型号SN1012，HD Communications Corp)和信号发生器(型号SN2130J6030，意大利PMM公司)。物节律单余弦模型分析软件(苏州大学)，有机玻璃辐射盒，睾酮和MelELISA试剂盒(购于上海易利生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1动物及分组 由苏州大学实验动物中心提供SPF级雄性SD大鼠110只，体质量(150±10)g，根据大鼠24 h自发活动昼夜节律筛选出87只、根据大鼠血浆Mel水平24 h昼夜节律筛选出60只昼夜节律无明显性差异的大鼠，随机分为照射组和对照组；照射组和对照组再各分为6个小组(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM)、每组5只。大鼠在环境温度20～26 ℃、湿度40%～70%下适应性喂养30 d，自由饮水进食，光照/黑暗(12 h ∶12 h)。通过自发活动系统采集大鼠24 h自发活动数据，再运用生物节律单余弦分析软件选择87只具有明显昼夜节律的大鼠，24 h尾静脉采血6次、每次间隔4 h，测血浆Mel水平，分析Mel水平的24 h昼夜节律。

1.2.2活动观察 观察室内放置4个大小为50 cm×50 cm×70 cm的隔光、隔声、独立的有机玻璃盒，盒内设饮水摄食装置；观察室内配有独立开关的红外线光源、人工白炽灯光源和摄像头，可拍摄大鼠的活动轨迹，视频信息输入电脑并通过软件分析得到大鼠自发活动平均速度。大鼠放入观察室内保持与外界隔光状态，适应1 d，观察24 h。每4 h摄像1次，每次观察30 min，然后分析24 h内不同时间段大鼠自发活动的平均速度。

1.2.3微波辐射 大鼠在有机玻璃辐射盒中通过微波辐射系统进行全身照射[6]，各组分别于2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM 、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM 时间点连续暴露1 h于2 000 μW/cm2900 MHz微波辐射环境中，每组1 h/d、共30 d；同时点放置对照组于有机玻璃盒中进行微波辐射假暴露(假暴露即为除不给予微波辐射外，其余同照射组相同)，1 h/d，其他饲养条件同照射组。

1.2.4血浆激素水平测定 所有大鼠在暴露结束后第0、4、8、12、16和20 h时尾静脉采血，离心15 min(1 500 r/min)，4 ℃保存，用ELISA法测定血浆T和Mel水平。

1.3 数据处理

1.3.1余弦分析 用生物节律单余弦模型分析软件进行分析，根据方程公式F(t)=M+Acos(ωt+Φ)拟合相位响应曲线(振幅A为上下波动的幅度、节律振荡的幅度，M为涨落变化的中线、节律的调整中值，ω为节律的角频率15°/h，Φ为振荡到达顶峰的时刻、又称为峰值相位，是最稳定的节律特征参数)，分析曲线时相变化确定是否存在昼夜节律，即对振幅A作F检验[7]。将大鼠6个时点血浆中Mel和T的水平用上述分析软件拟合出相位响应曲线再进行分析，此分析方法可分为组平均余弦法和单一余弦法。用生物节律单余弦模型分析软件进行相位响应曲线拟合每组动物6个时点激素水平的均值，得到各组大鼠的相位响应曲线，以描述各组节律特征，即为组平均余弦法；单一余弦法则是对每只大鼠6个时点的激素水平进行拟合分析，得到每只大鼠的A、M和Φ这3个参数，然后对各个参数进行分析。

2 结果

2.1 微波辐照前大鼠昼夜节律指标

照射组和对照组微波辐射前血浆Mel水平昼夜节律的3个指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。对表1中血浆Mel水平昼夜节律相位响应曲线振幅A作F检验，照射组和对照组血浆Mel水平均具有明显昼夜节律，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 辐照前大鼠血浆Mel水平昼夜节律指标(n=5)Tab.1 Circadian rhythmic parameters of melatonin in plasma of rats before microwave radiation(n=5)

注：(1)对A作F检验，P<0.05。

2.2 微波辐照对大鼠血浆Mel水平昼夜节律的影响

微波辐射后，对照组和照射组血浆Mel水平相位响应曲线如图1所示，6个时间点组微波暴露后，雄性大鼠血浆Mel水平相位响应曲线均发生了变化。对照组和照射组大鼠血浆Mel水平相位响应曲线各个时点振幅A作F检验 ，差异均有统计学意义(P<0.05)。将照射组和对照组相位响应曲线参数进行统计分析结果显示，2 ∶00 AM暴露于微波辐射的大鼠峰值时点对照组(18.10±1.88)ZT、照射组(8.73±1.01)ZT，与对照组比较，照射组峰值时点提前9.37 h，在6个时点中变化最大；2 ∶00 PM微波辐射照射组大鼠Mel水平相位响应曲线峰值对照组为(15.12±0.90)ZT、照射组为(14.19±1.24)ZT，照射组与对照组相比，在6个暴露时点中变化最小，峰值时点延迟0.93 h；白天辐射暴露(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值时点总差值为13.62 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值时点总差值为22.67 h，峰值时点是反映昼夜节律变化的敏感标志。实验结果显示，2 ∶00 AM是大鼠血浆Mel对微波辐射最为敏感的时间点，对其影响最大；而2 ∶00 PM是大鼠血浆Mel对微波辐射最不敏感的时间点，对其影响最小；提示黑夜辐射暴露对大鼠血浆Mel水平较白天明显。

2.3 微波辐照对大鼠血浆T水平昼夜节律的影响

照射组与对照组在微波辐射暴露后血浆T水平相位响应曲线如图2所示。由图可知，6个时点微波辐射后各组大鼠血浆T水平相位响应曲线均发生了变化。对照组血浆T水平相位响应曲线各个时点振幅A和照射组比较，如图2所示，对各组振幅A作F检验，差异均有统计学意义(P<0.05)。将照射组和对照组相位响应曲线参数进行统计分析，结果显示，6 ∶00 PM暴露于微波辐射的大鼠峰值时点为(0.61±0.76)ZT，对照组为(12.72±0.83)ZT，照射组与对照组比较，峰值时点提前12.11 h，在6个时点中变化最大；10 ∶00 AM暴露于微波辐射的大鼠血浆T水平相位响应曲线峰值时点为(9.17±0.69)ZT、对照组为(12.18±0.68)ZT，与对照组比较，照射组峰值时点提前3.01 h，在6个暴露时点中变化最小；白天辐射暴露(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值时点总差值为18.94 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值时点总差值为20.02 h。结果提示，6 ∶00 PM左右是大鼠血浆T对微波辐射最为敏感的时间点，对其影响最大；10 ∶00 AM左右是大鼠血浆T对微波辐射最不敏感的时间点，对其影响最小；提示黑夜辐射暴露对大鼠血浆T水平影响较白天明显。

注:A为10 ∶00 AM、B为10 ∶00 PM、C为2 ∶00 AM、D为2 ∶00 PM、E为6 ∶00 AM、F为6 ∶00 PM，图中ZT0点为自然时间9 ∶00 AM，横轴灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。图1 大鼠血浆Mel水平相位响应曲线结果Fig.1 PRCs for plasma of rats melatonin concentrations

注：A为10 ∶00 AM、B为10 ∶00 PM、C为2 ∶00 AM、D为2 ∶00 PM、E为6 ∶00 AM、F为6 ∶00 PM，图中ZT0点为自然时间9 ∶00 AM，横轴灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。图2 大鼠血浆T水平相位响应曲线结果Fig.2 PRCs for plasma of rats testosterone concentrations

3 讨论

WHO不育症防治专题组的研究表明生殖功能紊乱是男性不育最重要的病因之一。全世界具有不同程度生育障碍的育龄夫妇中约50%是男方因素。由于短时间内遗传变异造成的影响是有限的，过去50年中男性生殖功能有所下降，有可能是受到了某些环境有害因素的影响[8-9]。伴随科技的发展，各种电磁辐射暴露也越来越多，生殖器官作为电磁辐射的敏感器官，使得人们越来越重视其带来的影响。

本实验选择Mel水平作为筛选条件是由于松果体产生的Mel受光周期制约，体内Mel的含量呈昼夜性节律改变，从而使生物体的功能活动与外界的环境变化相适应，且Mel可通过下丘脑-垂体-性腺轴对生殖系统进行调节，下丘脑是Mel调节生殖系统的主要部位及靶器官[2,10-11]。本实验中照射组在辐射后Mel和T水平各个时点组均升高，提示Mel的变化可能对血浆T水平有影响，这与Shou等[12]的研究结果类似，其研究显示Mel可通过Leydig细胞的Mel受体影响睾丸的内分泌活动，影响血浆性激素水平。性激素对生殖系统功能起着关键作用，同时对环境适应、维持机体平衡和神经系统等也起着重要作用。雄性动物体内中T是最重要的性激素，T水平异常可干扰生殖内分泌系统，影响雄激素生物学作用，导致生殖功能紊乱，其激素改变可能是微波辐射影响雄性生殖功能的基础[13]。Myung等[14-15]的研究也认为电磁辐射能影响机体生殖内分泌功能。本实验显示不同时点微波暴露对血浆激素水平的影响不同，证实了电磁辐射对Mel和T的影响。2 ∶00 AM微波辐射对血浆Mel影响最大，说明其对微波辐射敏感时间为2 ∶00 AM左右；而微波辐射对血浆T影响最大的敏感时间段为6 ∶00 PM左右。由于机体对外界环境刺激的敏感度在一天中并不稳定，这也就解释了不同时点微波辐射对激素影响不同。本实验结果显示微波辐射在黑夜对大鼠血浆激素水平的影响较白天更为明显。然而，细胞感受电磁辐射物理信号、电磁辐射能量在生物组织转化及传递和引起敏感组织与细胞的损伤机理仍不清楚，电磁辐射影响的机制还需要进一步的研究。

本实验中，微波辐射在各个时点暴露对血浆Mel和T水平均有影响，表现为振幅和峰值时点改变、中值增高，但机体对不同时点微波辐射的敏感度不同，这也提示，可通过避免暴露于机体对微波辐射敏感的时间段来降低电磁辐射影响，为电磁辐射防护提供新思路和理论依据。