不同无性系白果的毒性和营养分析

胡亚平，米月颖，郭起荣，蔡金峰

（南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.林学院；c.江苏省种质资源保护与利用平台银杏种质圃，江苏 南京 210037）

长久以来，白果（Ginkgo bilobaseed）被作为一种“药食两用”的资源，最早记录出现在元朝的《日用本草》中[1]。《中国药典》（2015版）中描述其为性味甘苦涩，归肺经，具有敛肺定喘，止带缩尿之功效[2]。现代研究表明，白果中富含多种活性成分，具有较强的抗氧化性[3]、抗肿瘤[4]和治疗心脑血管等疾病的功效[5]。目前，国内大部分白果资源供食用，市场上有各种白果制成品出售，白果也被国家卫生健康委员会收录于食药两用中药品种目录中。

虽然白果药物利用价值高，药用疗效明显，但是白果中含有多种有毒成分，影响着白果资源的有效利用，制约白果产业的发展。有研究表明，白果中含有的多种致毒成分会导致人体出现间歇性痉挛、呕吐、全身性惊厥等中毒症状，严重的甚至造成死亡。白果中毒事件屡有报道，但多发于抵抗力较弱的孩童和老人群体[6]。《本草纲目》中记载“食多则收令太过，令人气壅胪胀昏顿”。1985年，日本科学家首次在白果中提取出4'-O-甲基吡哆醇（4'-O-methylpyridoxine，MPN），并证实MPN即白果中的主要致毒物质[7]。2000年，Scott等第1次在白果中检测出4'-O-甲基吡哆醇-5'-葡萄糖苷（MPN-5'-glucoside，MPNG）[8]；2011年，Kobayashi等在白果果仁中检测出MPN的糖基转化物，即MPNG，而且MPNG同样具有致毒作用，但其毒性小于MPN。科研人员把白果中的MPN和MPNG合称“银杏毒”（ginkgotoxin）[9]（图1）。有研究表明，熟白果和生白果中的主要致毒物质不同，生白果中主要为MPN，熟白果中主要为MPNG，但是生、熟白果中银杏毒的总量不变，说明加热熟化可以促进MPN转化为MPNG[10]。白果脱毒一直是白果产业发展所面临的一大技术难题。

图1 银杏毒成分结构化学式Fig.1 Structural chemical formula of ginkgotoxin

中国白果资源丰富，拥有世界70%左右的银杏资源。据统计，我国年产白果约19万t，主要产区为江苏、山东、湖北、四川、陕西和安徽等省份[11]，白果产业发展潜力巨大。白果脱毒技术尚未成熟，甄别来自不同产区无性系白果的营养和毒素含量，有利于白果产区调整种源结构，提升白果整体质量，可为白果产业健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

39个无性系白果均来自中国江苏省徐州市邳州国家银杏良种基地。20世纪90年代，以采集自全国各地及日本的优良母株枝条作为接穗，以2～3 m高的5 a实生幼树作为砧木，起始嫁接部位树干离地1.8～2.0 m处，每株砧木嫁接3～4根接穗，每个无性系嫁接6株。现各植株长势良好，结实正常。参试的39个无性系白果编号和母株原产地见表1。2018年10月，选取各种源长势中庸的一棵采集种实，去除外种皮，测量果实形态指标后，取出胚乳，-60 ℃低温冻干，研磨粉碎后过50目筛，备用。

表1 参试39个白果无性系的名称和来源Table 1 Names and origins of 39 G.biloba clones

1.2 主要仪器与设备

冷冻干燥机，购于美国Labconco公司；Waters arc二元高效液相色谱仪、SinoChrom ODS-BP色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），购于美国Waters公司；Millipore-Q超纯水制备仪；CAAM-2001多功能原子吸收光谱仪，购于北京瀚时制作所。

1.3 测定方法

1.3.1 果实形态指标

各无性系选取50颗白果，用游标卡尺测量白果的纵径和横径，然后取出胚乳冻干并称重。果形指数为纵径和横径的比值。

1.3.2 果实银杏毒含量

参考McAlpine等[12]的检测方法，采用高效液相色谱法检测白果中的银杏毒含量。

白果粉水提液的制备：称取0.5 g干燥白果粉，加入20 mL超纯水，震荡120 min，10 000 r/min离心10 min后收集上清液，重复2次。2次收集的上清液过0.22 μm滤膜后，定容至50 mL，备用。

液相色谱条件：流动相A为含5 mmol/L戊烷磺酸钠的5 mmol/L磷酸钾溶液，用磷酸调节pH至2.5；流动相B为乙腈。柱温30 ℃，进样量 20 μL，保留时间40 min，流速1 mL/min。检测条件为荧光发射波长395 nm，激发波长295 nm。梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 白果粉水提液液相色谱检测的梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution process of water extract of G.biloba seed powder in detection of liquid chromatography %

1.3.3 果实营养元素含量

采用原子吸收光谱法测定白果中K、Ca和Mg营养元素含量。取0.5 g干燥粉样置于凯氏烧瓶中，加入硝酸-高氯酸混合液10 mL，瓶口放置1个小漏斗，消煮时可减少蒸发，置于调温电炉上消煮，控制温度，使消煮液保持微沸。此时发生大量的二氧化氮棕色气体，当液体透明且无糊状时消煮完毕。将消煮完毕的待测液冷却后，定容至50 mL。使用原子吸收光谱仪测定待测液的K、Ca、Mg含量。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016对原始数据进行整理，使用SPSS 24.0进行统计分析，使用Origin 2016和ChemSketch 10进行绘图。

2 结果与分析

2.1 各无性系白果形态指标的比较

各无性系白果果形指数和百粒胚乳质量见 表3。由表3可知，不同无性系白果果形差异显著，2号和14号无性系白果最接近圆形，37号和38号无性系白果最狭长。各无性系白果的形态如图2所示，纵径和横径分布如图3所示。根据银杏核用品种分类，长宽比大于1.75的为长子品种；在1.50～1.75的为佛指品种；在1.30～1.50的为中指品种；小于1.30的为圆子品种[13]。本研究中参试39个无性系白果果形指数为1.16～1.81，覆盖了白果的4个类群，基本包括了主要白果产区的果实特性。白果胚乳质量与果形指数未表现出明显的线性相关性，无显著的相关性。2号无性系白果果形指数最小，为1.18±0.05，百粒胚乳质量为(43.85±0.06) g；37号无性系白果果形指数最大，为1.81±0.08，百粒胚乳质量为(56.75±0.05) g；29号无性系白果果形指数介于两者之间，为1.29±0.05，但是其百粒胚乳质量达到了(99.89±0.08) g，在各无性系白果中其胚乳质量最大。这可能与不同无性系白果胚乳和中种皮之间的空隙不同有关。

表3 各无性系白果果形指数和百粒胚乳质量†Table 3 Shape indexes and 100-seed endosperm masses of different clones of G.biloba seeds

图2 各无性系白果的形态Fig.2 Seed shapes of different G.biloba clones

图3 各无性系白果的纵径和横径分布Fig.3 Distribution of longitudinal and transverse diameters of different clones of G.biloba seeds

2.2 各无性系白果银杏毒含量的比较

白果中银杏毒成分主要分布在胚乳中。39个无性系白果胚乳中MPN平均含量为360.75 μg/g，MPNG平均含量为46.45 μg/g，各无性系白果银杏毒含量见表4。其中，MPN含量最高的是37号无性系，平均含量为(485.24±0.45) μg/g；含量最低的为39号无性系，平均含量为(247.44±0.41) μg/g，均与其他无性系具有显著差异（P＜0.05）。MPNG含量最高的是39号无性系，平均含量为(213.03±0.21) μg/g，远高于整体平均值，与其他无性系有显著差异；含量最低的为32号无性系，平均含量为(21.43±0.48) μg/g。

基于各无性系白果银杏毒含量，采用类平均法对其进行系统聚类，结果如图4所示。由图4可见，39个无性系可分成4类。4号、6号、9号、16号和27号无性系为一类，其平均MPN含量为309.67 μg/g，MPNG含量为38.40 μg/g，银杏毒含量为348.07 μg/g。1号、5号、7号、17号和37号无性系为一类，其平均MPN含量为441.88 μg/g，MPNG含量为 48.00 μg/g，银杏毒含量为489.88 μg/g。19号、20号、21号、22号、24号、26号、30号、31号、33号、34号和39号无性系为一类，其平均MPN含量为356.99 μg/g，MPNG含量为68.63 μg/g，银 杏毒含量为425.62 μg/g。其余无性系为一类，其平均MPN含量为347.69 μg/g，MPNG含量为41.06 μg/g，银杏毒含量为385.75 μg/g。

表4 各无性系白果银杏毒含量 Table 4 Ginkgotoxin contents in different clones of G.biloba seeds μg/g

2.3 各无性系白果营养元素含量的比较

白果药食两用，其营养元素含量丰富。各无性系白果营养元素含量见表5。由表5可知，39个无性系白果中，K、Ca和Mg平均含量为(0.60±0.04)、(0.19±0.02)、(0.48±0.01) mg/g，略高于食用板栗的含量。不同无性系白果K、Ca和Mg营养元素的含量较为相近。

图4 基于白果银杏毒含量的参试无性系聚类结果Fig.4 Cluster results of tested clones base on ginkgotoxin contents in G.biloba seeds

3 结论与讨论

本研究结果表明，不同无性系白果果形和银杏毒含量差异显著，白果果形指数为1.16～1.81。银杏毒总量最高为525.79 μg/g，总量最低为330 μg/g。其中MPN含量最高为485.24 μg/g，含量最低为247.44 μg/g；MPNG含量最高为213.03 μg/g，含量最低为21.43 μg/g。根据白果总银杏毒含量对各无性系进行系统聚类，39个无性系白果可以分为4类。不同无性系白果的营养元素含量较为接近。

银杏是孑遗物种，极少出现形态分化，各品种之间形态差异较小，品种鉴别困难，尤其是银杏苗期的品种鉴定[14]。但是不同品种的白果外形差异较为明显，可以作为判断的依据之一。与被子植物相比，大多数裸子植物的质体DNA表现为父系遗传，本研究结果显示白果果形是以母系遗传为主。白果中种皮与胚乳之间靠近种柄端具有一层空腔，根据本研究结果，体积大的白果胚乳质量不一定大，说明白果空腔体积不能简单依据白果体积来判断。空腔的发育过程和作用有待进一步探讨。

MPN与维生素B6具有相似结构，MPN进入人体后会与维生素B6产生拮抗作用，导致人体维生素B6含量显著下降，可能出现抽搐惊厥、昏迷甚至死亡等症状[15]，所以生白果比熟白果具有更高的毒性，因此不建议生食白果。白果中致毒物质除银杏毒外，还有氢氰酸[16]、致敏蛋白[17]、银杏酚酸[18]等物质。已有关于不同致毒物质的毒性药理研究的大量报道[19]，部分有毒重要成分经过合理的结构修饰，可以转化为无毒成分，起到减毒增效的作用。但目前仍缺乏一套科学、有效、经济的脱毒工艺。以传统中药炮制、配伍减毒方法为基础，结合新型减毒方法的同时，借鉴并吸收农副产品中的脱毒手段，合理利用生物技术，探索并开发新型的白果减毒工艺，应用到白果加工和产业化生产中，对白果产业的发展至关重要。

表5 各无性系白果营养元素含量 Table 5 Nutrient contents in different clones of G.biloba seeds mg/g

白果虽有毒，但是也含有丰富的营养成分。除含有蛋白质、脂肪、淀粉和糖类外，白果还含有丰富的有益于身体健康的卵磷脂、维生素、微量元素和重要的氨基酸[20-22]。本研究中各无性系白果生长环境一致，可能是导致不同无性系白果中各营养元素含量差异不显著的原因之一。能否通过改善种植条件和技术手段来提升不同无性系白果的营养价值，须在生产实践中进行验证。白果成熟后银杏毒含量与储存时间的关系，白果脱毒新工艺，及白果不同毒性物质间是否具有协同或者拮抗作用均有待深入探讨。