Graves病患者肠道菌群多样性分析

孙博文 杨孟雪， 刘军 周雪 李飞 杨波

1遵义医科大学附属医院内分泌科（贵州遵义563000）；2复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌科（上海200240）

Graves 病（Graves disease，GD）是最常见的器官特异性自身免疫疾病之一，部分病因是由于自身对甲状腺抗原的免疫耐受减弱，从而导致致病性自身反应性T 和B 淋巴细胞攻击甲状腺滤泡细胞。其主要特征为血清中存在针对甲状腺细胞的TSH 受体抗体（TRAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）及甲状腺球蛋白抗体（TgAb）。而肠道微生物群紊乱可能是潜在的病因之一，有研究发现在桥本甲状腺炎患者中，检测到十二指肠远端肠微绒毛厚度的变化和相邻微绒毛间隙的增加，肠道黏膜屏障通透性增加［1］，而毒素、抗原、细菌代谢物、甚至细菌易位，从肠道进入血液引起持续炎症刺激可以触发自身免疫，引发自身免疫性疾病［2］。随着测序技术的发展，研究发现肠道菌群对于维持宿主的营养、代谢和免疫稳态方面发挥着重要作用，肠道菌群紊乱已被证明在类风湿关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等疾病的发生发展中起重要作用［3-5］。而肠道菌群紊乱与Graves 病的相关研究目前国内外鲜有报道，因此，基于以上因素本研究以Graves 病患者为研究对象，通过细菌16S rRNA 扩增、测序、生物学分析，探讨疾病状态下的肠道微生物组成和结构的特征，有助于对疾病的发病机制提出新的见解。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2018年9月至2019年2月期间就诊于遵义医科大学附属医院内分泌科18 例初诊未经过任何治疗的Graves 病患者纳入Graves病组（GD 组），同期于体检中心体检健康者11 例作为正常对照组（NC 组）。（1）GD 组纳入标准：①诊断标准：参照2008年中华医学会内分泌学会《中国甲状腺疾病诊治指南》，且未经过任何治疗；②自愿参与并配合该研究，签署相关知情同意书。（2）NC 组纳入标准：①无Graves 病及其他器质性病变；②实验室常规检验（血、尿、便常规，肝肾功能、血脂、血糖、C-反应蛋白等）及检查（胸片、心电图、腹部常规彩超）未见明显异常；③年龄、性别相匹配，并自愿参与配合该研究，签署相关知情同意书。（3）所有受试者排除标准：①近1 个月来服用益生菌、益生元等微生态制剂，抗生素、中草药等可能对肠道菌群有影响的药物；②近1 个月来合并感染相关性疾病及其他疾病；③应激状态下。

1.2 标本采集使用专用的粪便收集容器严格按照无菌观念采集受试者新鲜大便约10 g，迅速放入无菌冰盒，转运至-80 ℃冰箱保存。

1.3 粪便菌群DNA的提取以微生物核糖体RNA能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，根据序列中的保守区域设计相应引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。添加特异性Barcode序列，进而对16S rRNA 基因可变区，即V3-V4 区进行PCR 扩增。PCR 扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收并进行荧光定量。

1.4 Illumina MiSeq 测序采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，将合格的各序列进行上机测序。

1.5 数据分析

1.5.1 OTU 划分和分类地位鉴定以97%的序列相似度作为OTU（Operational Taxonomic Unit，可操作分类单元）划分阈值，该阈值大致相当于分类学中物种（Species）水平的序列差异，将丰度值低于全体样本测序总量0.001%（十万分之一）的OTU去除，根据每个OTU 在每个样本中所包含的序列数，构建OTU 在各样本中丰度的矩阵。采用Greengenes数据库对OTU 自门、纲、目、科、属、种水平进行分类地位鉴定并统计。

1.5.2 肠道群落的多样性分析计算Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数、Simpson 指数并利用Wilcoxon 秩和检验进行差异检验，绘制稀疏曲线。使用R 软件对Weighted 的UniFrac 距离矩阵分别进行NMDS 分析，并二维排序图描述群落样本的结构分布。根据OTU 划分和分类地位鉴定结果，获得每个样本在门、纲、目、科、属各分类水平的具体组成。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析及GraphPad Prism 5.0 作图。正态分布计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布数据以中位数（四分位间距）表示，两组间比较采用曼-惠特尼秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组一般临床资料的比较GD 组及NC 组均在提供当天相关检查及检验结果及符合排除标准情况下，留取粪便样本。2 组性别、年龄、体质量指数相关指标的比较，见表1。

表1 2 组一般临床资料的比较Tab.1 Comparison of general clinical data between the two groups ±s

表1 2 组一般临床资料的比较Tab.1 Comparison of general clinical data between the two groups ±s

项目性别（男/女，例）年龄（images/BZ_18_1084_2516_1109_2559.png±s，岁）BMI（images/BZ_18_1084_2516_1109_2559.png±s，kg/m2）正常对照组（n=11）5/6 28.91±10.82 21.27±1.42 Graves病组（n=18）7/11 36.67±11.167 20.31±1.69 P值-＞0.05＞0.05

2.2 2 组OTUs 的Venn 图Illumina 测 序 共 测 得1 200 665 条高质量序列，其中正常对照组中获得477 940 条序列；Graves 病组中获得了722 725 条序列；每个样本平均含有（41 402 ± 6 733）条有效序列。根据获得的OTU 丰度矩阵，使用R 软件计算2 组OTU 的数量，并通过绘制OTUs 的Venn 图直观地呈现2 组所共有和独有OTU 所占数量。NC 组特有409 个OTU，GD 组特有525 个OTU，其中两组共有1 253 个OTU 相互重叠，见图1。

2.3 2 组肠道菌群Alpha 多样性分析侧重于体现群落丰富度Chao1 指数和ACE 指数，以及兼顾群落均匀度的Shannon 指数和Simpson 指数统计结果显示，两组间Chao1 指数、ACE 指数、Shannon 指数及Simpson 指数差异没有统计学意义（P＞0.05），见表2。并绘制稀疏曲线，在图中随着测序深度加深，曲线逐渐趋于平缓，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，见图2。虽然2 组 间Chao1 指 数、ACE 指数、Shannon 指 数及Simpson 指数没有统计学差异，但NC 组均大于GD组，表明Graves 病患者肠道菌群生物多样性降低。

图1 OTUs 的Venn 图Fig.1 Venn diagram of GD and NC groups at OTU level

图2 Chao1 指数、Shannon 指数的稀疏曲线图Fig.2 The Rarefaction curve of the Chao1 and the Shannon Index between the two groups

2.4 2 组肠道菌群Beta 多样性分析通过样本距离矩阵降维处理简化数据结构，在低维坐标系中对样本重新排序描述样本的分布特征，考察不同样本之间群落结构结构的相似性。在Weighted UniFrac NMDS 分析的样本二维排序图中2 组之间有一定的重叠，但整体GD 组和NC 组肠道群落结构可以区分开，见图3。

表2 2 组Alpha 多样性指数数据表Tab.2 Alpha diversity index data sheet between the two groups M（P25，P75）

图3 Weighted UniFrac NMDS 分析的样本二维排序图Fig.3 Two-dimensional sorting Diagram of samples analyzed by Weighted UniFrac NMDS between the two groups

2.5 2 组肠道菌群在门及属水平分类学组成分析在2 组粪便样本中检测到厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蛋白菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、梭杆菌门（Fusobacteria）、Cyanobacteria、TM7、Tenericutes 等菌门，其中厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门及蛋白菌门为优势菌门，占细菌总数99%以上。用Metastats 统计学算法对门水平的各个分类单元在组之间的序列量差异进行比较检验得到GD 组厚壁菌门相对丰度低于NC 组（P＜0.05），而放线菌门相对丰度高于NC 组（P＜0.05），见图4、5。

进一步对属水平的各个分类单元在组之间的序列量差异比较检验，同样利用Metastats 统计学算法进行检验结果显示2 组属水平有21 个分类单元具有统计学差异，绘制如下图呈现各分类单元在2 组内的丰度分布。GD 病组双歧杆菌属（Bifidobacterium）、柯林斯氏菌属（Collinsella）、Pediococcus、N09、02d06、Enterobacter 、Bulleidia、Weissella、Gemella、Granulicatella 相对于NC 组优势丰度分布（P＜0.05），而罗斯氏菌属（Roseburia）、小杆菌属（Dialister）、Thermus、Slackia、［Prevotella］、Oxalobacter、Mycoplana、Anaerostipes、Butyricimonas、Corynebacterium、Odoribacter 相对丰度低于NC 组（P＜0.05）见图6。

图4 2 组各门水平相对丰度柱状图Fig.4 Relative abundance histogram of the Phylum between the two groups

图5 2 组间相对丰度＞0.1%门水平物种柱状图Fig.5 Histogram of relative abundance ＞0.1%of the Phylum between the two groups

3 讨论

图6 2 组具有统计学差异的属相对丰度柱状图（P＜0.05）Fig.6 Histogram at Genus level between the two groups（P＜0.05）

近年来，随着16S rRNA 基因高通量测序技术的发展，其以测序程度深和准确率高等优点目前被广泛应用于肠道菌群研究中。肠道菌群与自身免疫相关疾病之间的关系成为近年来的研究热点，虽然Graves 病的发病机制目前尚未完全明确，但可以确定的是在遗传易感性基础上，环境因素导致的免疫功能紊乱已被证明是重要的组成部分，诸多研究表明肠道菌群与Graves 病相关联。

本研究对初诊Graves 病患者肠道菌群组成和结构进行分析并与健康人群进行比较，通过对细菌16S rRNA 基因中的V3、V4 可变区进行基因扩增、测序，研究结果表明与体现肠道细菌群落丰富程度的Chao1 指数和ACE 指数以及兼顾群落均匀度的Shannon 指数和Simpson 指数Graves 病组均小于正常对照组，即Graves 病患者的肠道菌群多样性相比较健康人群降低。

通过利用Metastats 分析得出2 组间厚壁菌门、放线菌门、Cyanobacteria、TM7、Thermi 有显著统计学差异，其中Cyanobacteria、TM7、Thermi 相对丰度极低（＜0.001%），且仅在极个别粪便样本中检出，GD 组患者中厚壁菌门丰度降低，放线菌门增高（P＜0.05）。进一步分类鉴定至属水平发现引起Graves 病组放线菌门水平显著差异的物种为双歧杆菌属、柯林斯氏菌属，并高于正常对照组（P＜0.05），而罗斯氏菌属、小杆菌属显著低于正常对照组（P＜0.05）。

相关研究表明Th17 和Treg 细胞可能参与Graves 病的发病［6-7］，Graves 病和桥本甲状腺炎患者外周血Th17 细胞及IL-17 比例高于对照组，在难治性Graves 病患者中，显著高于缓解期患者［8］，Graves 眼病活动期患者血清IL-17 水平升高尤其明显，Th17 细胞水平与Graves 眼病严重程度之间呈正相关［8-9］。Treg 细胞通过IL-10 和TGF-β等调节因子的分泌可以抑制自身反应性T、B 细胞，而维持自身免疫耐受［10］。本研究发现肠道有益菌罗斯氏菌属在Graves 病患者中显著降低（P＜0.05），而研究发现罗斯氏菌属可以通过分解难以消化的碳水化合物生产乙酸，丙酸，丁酸等短链脂肪酸（SCFA）［11］，很可能通过释放SCFA 在肠道中的诱导Treg 细胞的产生并促进功能［12］。其中丁酸盐可以通过激活细胞受体HCA2，使Treg 细胞和IL-10产生增多，丙酸盐和乙酸盐能促进外周Treg 细胞生成，特别是丁酸能增强Fox-P3 基因内含子保守的非编码序列中组蛋白H3 的乙酰化，从而促进胸腺外产生Treg 细胞［13］。

本研究发现柯林斯氏菌属在Graves 患者中显著增多（P＜0.05），而该菌是一种可能诱导并加重自身免疫疾病的致病菌，在类风湿关节炎患者肠道菌群中该菌丰度显著升高，并与该病的发生相关［3］。研究发现柯林斯氏菌属的丰度与具有促炎作用的IL-17 产生有关［3］，柯林斯氏菌属通过降低上皮细胞中紧密连接蛋白（ZO-1）的表达，诱导IL-17A、RORα和趋化因子CXCL 1 和CXCL 5 的表达增加，而RORα、CXCL 1 和CXCL 5 又可以调控IL-17 的产生［14-15］，并增加肠道黏膜屏障的通透性。因此，柯林斯氏菌属可能通过改变肠道黏膜通透性及诱导IL-17 等细胞因子表达参与Graves病的发病。

本研究发现Graves 组显著增高的另一种菌属为双歧杆菌属，该菌的一些菌株被认为是能对机体产生有利影响的益生菌，在治疗急性感染性腹泻、抗生素相关性腹泻、溃疡性结肠炎、肠易激综合征等疾病方面显示了其疗效［16-18］。双歧杆菌及乳杆菌属的某些特定菌株可以通过改变外周血淋巴细胞亚群来调节人体免疫系统的反应［19］，但微生物没有绝对的“好”与“坏”，有研究报道服用益生菌可通过产生Th1 导致炎症反应，对患有Th1 介导的自身免疫性疾病的患者产生负面影响［20］。今年来有研究表明双歧杆菌属某些特定菌株可能通过分子模拟机制参与触发自身免疫性甲状腺疾病，在人血清中检测到了一些针对双歧杆菌抗原的特异性抗体，双歧杆菌和乳酸菌属某些特定菌株的氨基酸序列与甲状腺过氧化物酶（TPO）和甲状腺球蛋白（Tg）有共同的氨基酸序列，并可以选择性地结合自身抗体，可能通过分子模拟机制参与触发Graves 病［21］。

综上所述，本研究表明Graves 病患者中的肠道生物多样性降低，我们推测柯林斯氏菌属、双歧杆菌属的某些特定菌株及罗斯氏菌属等细菌的改变可能与Graves 病发生发展有关，Graves 病患者肠道有益菌减少，而有害菌增多，肠道处于慢性炎症状态导致免疫炎症轴失衡及肠道肠道黏膜屏障通透性增加，肠道细菌代谢物、细菌抗原、甚至细菌易位，从肠道进入血液引起持续炎症刺激可以触发自身免疫，可能导致或者加重Graves 病，本研究为今后研究自身免疫性甲状腺疾病的病因和诊治提供新思路。

由于该研究Graves 病样本量相对较少以及存在地区差异，而且粪便中的菌群并不能完全反映在肠道黏膜中定植的肠道菌群，所以本研究有一定的局限性。这需要扩大样本及进一步从机制上研究肠道菌群在Graves 病发病中的作用。除了加大样本量外，还需要建立动物模型验证实验结果，并对相关差异菌导致的具体机制深入探讨。