RS4型抗性淀粉对大鼠血清免疫球蛋白含量、免疫器官发育和盲肠黏膜形态结构的影响

2020-05-06李凌岩高伟星杨敏娜胡杰张爱忠曲永利

黑龙江八一农垦大学学报 2020年2期

李凌岩，高伟星，杨敏娜，胡杰，张爱忠，曲永利

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

淀粉是动物日粮中最重要的营养素之一，是动物机体代谢产能的重要营养物质。一般来说，淀粉主要在小肠分解生成葡萄糖作为最终产品被消化吸收。不同饲料来源的淀粉在肠道中的消化和吸收速率不同。这主要取决于三个因素，一是淀粉的物理和化学特性，二是饲料的加工程度和类型，三是动物本身的影响[1-2]。根据淀粉被肠道消化速度和程度可将淀粉分为快速降解淀粉（Rapidly Digestible Starch，RDS）、慢速降解淀粉（Slowly Digestible Starch，SDS）和抗性淀粉（Resistant Starch，RS）[3-4]。其中 RS 是最特殊的一种淀粉，它是指在动物小肠内不能被淀粉酶分解，但在大肠内经微生物发酵产生次生代谢产物而发挥其生理功能的淀粉。

RS天然的存在于各种食物中，由于RS的产生热量值较低并且RS对食品的质构和味道没有副作用。因此被广泛添加到各种食品里面。根据淀粉的来源和抗酶解特性差异可将抗性淀粉分为5类（RS1、RS2、RS3、RS4 和 RS5）。RS1 为物理包被淀粉，常见于轻度碾磨的谷粒或种子中，它是通过机械加工而使淀粉颗粒由于包被效果产生物理屏蔽作用，被锁在植物细胞壁上使其不能为淀粉酶所降解[5]。RS2为生淀粉颗粒，是指因本身的构象或结构而具有抗酶解特性的天然淀粉颗粒，如生马铃薯淀粉、绿色香蕉以及高直连玉米淀粉[6]。根据直连淀粉的含量，RS2还可以进一步划分为两个不同的类别，即RS2a和RS2b。RS2a直链淀粉含量在0～30%，属于正常的直链淀粉范围。而RS2b直链淀粉比例超过30%，即使是在饲料加工过程中依然保持其结构的稳定性和抗酶解的特性。RS1和RS2在小肠内的消化非常缓慢并且不完全，然而RS1和RS2经过适当加工后仍可被淀粉酶消化吸收。RS3是最主要的抗性淀粉，它是指是糊化淀粉冷却后生成的非颗粒状淀粉聚合物，也被称为老化淀粉[7]。RS3型抗性淀粉可分为RS3a和RS3b两种类型，其中RS3a中糊化淀粉冷却后生成的非颗粒状淀粉聚合物主要为支链淀粉，RS3b中糊化淀粉冷却后生成的非颗粒状淀粉聚合物主要为直链淀粉。RS3b的抗酶解性最强，而RS3a可经过再加热而被淀粉酶降解。目前对于RS3的抗酶解机理存在2种观点：第一种观点认为是由于直链淀粉聚合物的形成，妨碍淀粉酶靠近结晶区域的D-葡萄糖苷键，从而使淀粉酶活性基团中的结合部位与淀粉分子不能有效结合，使淀粉难于被淀粉酶作用，从而产生抗酶解特性；第二种观点认为RS3之所以能抵抗酶的水解，是由于形成直链淀粉晶体的双螺旋之间存在较强的氢键及范德华力，使得RS3的分子结构非常牢固，热稳定性强，因而在人体的胃肠道内不能被消化吸收。在饲料加工过程中，大多数湿热加工饲料可能含有RS3，但加工条件和随后冷却的差异会影响其相对含量。RS4为化学改性淀粉，通过化学手段将使原本的官能团发生变化或者引入新的官能团，从而提高淀粉的抗酶消化作用，包括羧甲基淀粉、淀粉醚、淀粉酯和交联淀粉等[8]。RS4的抗性水平取决于所使用的淀粉以及所用的化学修饰反应。RS5型抗性淀粉是指直链淀粉和支链淀粉的分支与脂肪酸形成的复合产物以及麦芽糊精，如含有淀粉和脂质的谷物和食品，RS5型抗性淀粉能够被部分被消化但是其消化速度较为缓慢。当淀粉与脂质在体系中共存时可以发生结合，从而形成聚合体来抵抗酶的水解。由于脂质中含有醇羟基和羧基，因此，在一定条件下，脂质中的碳链可与较长的淀粉分子产生较强的分子间作用力，然后脂质再通过一定的折叠效应与淀粉分子紧密结合在一起，这样可以抑制淀粉酶对聚合体系的降解能力。上述5种不同类型的抗性淀粉的性质与非淀粉多糖、非消化性低聚糖和益生元类似，被认为是溶解性纤维，属于膳食纤维。

膳食纤维可以刺激肠道的蠕动，帮助肠道进行正常的消化。相关研究表明，RS作为一种功能性食品被认为是潜在的益生元来源，RS在大肠中被细菌发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等次级代谢产物可以有效刺激肠道上皮细胞的发育、生长和更新，有利于肠道上皮细胞保持完整性[9]。RS发酵产生的挥发性脂肪酸可以降低肠道内的pH值，从而降低肠道有害物质如氨、短链酚和吲哚的生成。同时，RS可以通过选择性地刺激大肠中特定细菌的生长和活性，有利于宿主保持肠道的健康环境[10]。目前，关于RS对动物肠道健康的方面的研究很多，主要集中在对肠道代谢产物和菌群变化影响等方面。而关于RS对生长期大鼠机体免疫功能建立和肠道发育方面影响的研究却鲜见报道。因此，试验以SD大鼠为模型，饲喂不同浓度（5%、10%、15%）的RS4型抗性淀粉，研究RS4对生长期大鼠免疫性能和肠道发育的影响。为合理利用RS4型抗性淀粉，促进动物机体健康提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

试验动物选择健康的、初始体重为（66.54±10.23）g的SD雌性大鼠36只（3周龄），所有试验大鼠购买于黑龙江省哈尔滨市实验动物繁育基地。抗性淀粉选择RS4型抗性淀粉（其中RS含量为79.8%），由吉林挚友科技有限公司提供。

1.2 试验设计

试验采用单因素试验设计，将36只试验大鼠随机分为4组（1个对照组和3个处理组），每组各9只大鼠。对照组参照国标（GB14924.3-2001）饲养标准配制不含RS（0）的基础日粮（参见表1）。处理组使用RS4型抗性淀粉替代基础日粮中的糯玉米淀粉，使RS4占饲料比例分别为5%、10%和15%。试验预饲期为3 d，在观察到大鼠无中毒现象和异常行为后，开始进行正式饲喂试验，试验期天数共计40 d。

表1 基础日粮组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Ingredients and nutrition of RS-free basal diet

1.3 试验指标测定

1.3.1 血清免疫指标测定

试验最后一天将大鼠处死后采集血液，收集至采血管。离心 10 min（3 000 r·min-1）分离血清，置于-20℃冰箱保存，随后测定血清免疫相关指标：即免疫球蛋G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）在血清中的含量。免疫球蛋白酶联免疫反应测定的试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，测定方法均严格依照试剂盒内说明书步骤进行。

1.3.2 免疫器官指数测定

大鼠处死后，分离其胸腺、肝脏和脾脏，将其用生理盐水漂洗后用滤纸擦干，然后进行称重。计算免疫器官指数。

1.3.3 盲肠上皮细胞形态结构观察

将试验大鼠处死后，打开腹腔，分离肠道组织，剪取盲肠中段1 cm组织一段，放入装有4%甲醛溶液的小瓶中固定。制作组织切片时将固定后的大鼠盲肠组织用冰生理盐水冲洗干净，将组织在梯度酒精中逐级脱水后，经透明、透蜡、包埋、切片、贴片等处理后，采用苏木精-伊红（HE）染色方法进行染色。在光学显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）低倍镜（50×）下观察并进行显微拍照。使用广州明美成像系统软件对盲肠绒毛高度和隐窝深度进行测量。

1.4 统计分析

统计数据以平均值±标准差表示，运用SPSS软件中的ANOVA过程进行方差分析，当差异显著时，采用Duncan法进行多重比较。试验数据统计结果以P<0.05表示差异显著，P<0.1作为有差异的趋势来讨论。

2 试验结果

2.1 饲粮中不同RS4型抗性淀粉水平对大鼠血清免疫指标的影响

由表2可以看出，与对照组相比，随着饲粮中RS4型抗性淀粉水平的增加，各组大鼠血清中的IgG含量差异不显著；而血清中的IgA的含量呈现增加的趋势，饲喂15%RS4型抗性淀粉组大鼠血清中的IgA含量显著高于对照组和饲喂5%RS4抗性淀粉组（P<0.05）；饲喂15%RS4型抗性淀粉组大鼠血清中的IgM含量显著高于其他各组（P<0.05）。

2.2 饲粮中不同RS4型抗性淀粉水平对大鼠免疫器官指数的影响

由表3可以看出，与对照组相比，随着饲粮中RS4型抗性淀粉水平的增加，大鼠的胸腺指数和肝脏指数差异不显著。脾脏指数随着RS4型抗性淀粉水平的增加而增加，饲喂15%RS4型抗性淀粉组大鼠的脾脏指数显著高于其他各组（P<0.05）。

2.3 饲粮中不同RS4型抗性淀粉水平对大鼠盲肠黏膜形态结构的影响

由表4可以看出，与对照组相比，饲喂15%RS4型抗性淀粉组大鼠的盲肠绒毛高度显著降低（P<0.05）。隐窝深度各组之间差异不显著。饲喂10%RS4型抗性淀粉组大鼠的绒毛高度和隐窝深度的比值高于其他3组，且差异显著（P<0.05）。

表4 饲粮中不同RS4型抗性淀粉水平对大鼠盲肠上皮细胞形态结构的影响Table 4 Effects of different dietary RS4 levels on cecal morphology of rats

3 讨论

免疫系统由免疫组织、免疫器官、免疫细胞及免疫活性分子等组成。免疫球蛋白是免疫活性分子中的一类。是具有抗体活性的动物蛋白。主要是由浆细胞分泌的大型Y形蛋白质，大部分存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。其中IgG、IgA、IgM是最重要的3种免疫球蛋白。免疫球蛋白在动物机体内主要发挥特异性免疫的作用。免疫球蛋白可以被免疫系统用来鉴别与杀死外来物质如细菌、病毒等病原体。抵抗外界病菌入侵动物机体，是动物机体内重要的免疫防御系统。血清中含量最高的是IgG，它的主要作用是识别和消灭侵入体内的病原。因为IgG比其他的免疫球蛋白体积小，具有极强的渗透能力，可以游离出血液循环系统，识别身体其他组织的病原。增强机体免疫系统消灭病毒和细菌的能力；IgM的分子体积大，是动物机体内最早出现的免疫球蛋白之一，IgM不能游离出血管，因此它的作用主要是在血管中清除侵入的细菌，具有中和体内病毒，溶解细菌和坏死细胞的能力。IgA在血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白的10%～20%，存在于粘膜组织，例如消化道、呼吸道以及泌尿生殖系统。黏膜组织具有黏膜层淋巴组织，会制造出IgA以避免遭到病原的入侵，也存在于唾液、泪液以及乳汁当中，尤其是初乳当中IgA的含量相当高[11]。依照IgA在身体体内的分布，可以分成血清型和分泌型。血清型IgA存在于血清中，血清IgA具有某些IgG和IgM的免疫功能，特异性IgA能中和血液中的抗原，同时也出现替代性补体免疫系统[12]。分泌型IgA是身体局部黏膜抗感染免疫的主要抗体。故又称黏膜免疫抗体，它的主要作用是保护黏膜表面，比如肠道黏膜。它附着在肠道黏膜表面，防止病原附着而引发疾病。从试验研究结果来看，饲粮中添加抗性淀粉可以增加试验组大鼠血清中IgA和IgM的含量，增强了大鼠的特异性免疫能力。Wang et al[13]研究表明，饲粮纤维含量的增加可以提高仔猪血清中IgG、IgA和IgM的浓度。刘艳丽等[14]发现中草药合生元提高了断奶仔猪血清中IgG、IgA和IgM的含量，这表明抗性淀粉和合生元等膳食纤维对于提高动物机体的体液免疫功能具有积极作用。

胸腺、肝脏和脾脏是动物机体重要的免疫器官，其免疫器官指数在一定程度上反映免疫器官的发育程度和机体免疫功能的强弱。胸腺是重要的中枢免疫器官，是T淋巴细胞繁殖、分化、凋亡的场所；胸腺能够促进肥大细胞的增殖，使免疫系统维持平衡与稳定，促进各个免疫器官协同免疫[15-16]；并且胸腺分泌的胸腺素参与细胞免疫；胸腺的发育程度将影响体液免疫的效果。肝脏不仅具有内分泌功能，而且可参与机体局部或整体水平的免疫调节，肝脏也是除胸腺以外的T细胞分化的重要场所。脾脏是动物机体血液过滤器和贮存库。属于外周免疫器官，含有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，是动物机体内发生免疫应答主要场所，脾脏发育的状态直接影响机体免疫的效果[17-18]。苏勇等[19]使用葛根膳食纤维饲喂小鼠后发现其胸腺指数和脾脏指数都有显著的增加。刘鹤翔等[20]研究发现日粮中添加大豆低聚糖可以显著提高42日龄湘黄鸡的免疫器官指数。朱翠玲[21]发现小麦麸皮多糖可以提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数。从试验研究结果来看，饲粮中添加RS4型抗性淀粉对大鼠胸腺和肝脏指数无显著影响。脾脏指数随着RS4型抗性淀粉含量的增加而提高，说明饲粮中添加RS4型抗性淀粉有利于大鼠脾脏的发育。

盲肠的绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度比值是衡量盲肠黏膜形态结构完整性和健康的重要指标，间接反映了肠道的消化和吸收能力[22-23]。绒毛高度的增加意味着成熟绒毛细胞增加，肠道吸收养分能力增加，反之则降低。隐窝深度反映的是肠道上皮细胞的成熟率，隐窝变深则说明绒毛上皮细胞成熟率下降，分泌能力降低。绒毛高度/隐窝深度比值越高则表明肠道的消化能力增强，比值越小则表示肠道的消化能力下降，黏膜受损，影响消化吸收。骞宇[24]研究发现饲粮中添加RS4型抗性淀粉显著降低了盲肠绒毛高度。邬应龙[25]研究表明RS4型甘薯抗性淀粉可以增加高脂饮食小鼠的小肠绒毛高度，减小隐窝深度，增加绒毛高度/隐窝深度比值，减弱高脂饮食带来的肠黏膜损伤，保持肠道健康和完整性。从研究结果来看，与对照组相比，饲粮中添加低剂量（5%，10%）RS4型抗性淀粉增加了大鼠盲肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值，减小了隐窝深度。对盲肠形态结构的完整性具有积极作用，而长期摄入高浓度（15%）RS4型抗性淀粉则会对盲肠的形态结构造成损伤，对其正常生理功能产生负面影响。