沙棘蛋白的特性及其对db/db糖尿病小鼠的降血糖作用

刘洪霞,舒丹阳,刘鹏展,崔 春,*

(1.完美(广东)日用品有限公司,广东中山 528400;2.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一种天然的药食同源性植物,我国是沙棘资源最丰富的国家,沙棘属种植总面积达到92万hm2。沙棘的根、茎、叶、花、果实中均含有丰富的营养和生物活性物质。根据《中华人名共和国药典》记载,沙棘“具有止咳祛痰、消食化滞、活血散瘀功能”,充分肯定了它的药用价值。沙棘在民间还有“长寿果”的美誉,特别是藏医和蒙医使用较多[1]。沙棘具有抗肿瘤[2]、抗光老化[3]、抗氧化[4]、排铅[5]等多种活性。沙棘籽是沙棘果汁生产的副产物。沙棘籽经过超临界提取油脂后得到的沙棘籽粕中蛋白质含量丰富,约为20%～25%,富含多种人体所需氨基酸,是一种优质的功能性蛋白资源[6]。研究表明,沙棘蛋白能够改善血脂水平,调节肠道菌群[7];还能改善高血糖引起的细胞炎症[8]。

糖尿病是全球性的公共健康问题,是一种常见的慢性代谢疾病,主要表现为糖代谢紊乱,其病因诸多,机制复杂,已经成为继心血管疾病、恶性肿瘤之后的第三大疾病[9]。近10年来糖尿病流行情况日益普遍,预计至2030年全球糖尿病患者将达到4.39亿,其中2型糖尿病约占患病总人数的90%[10]。药物降血糖会产生多种副作用,降低骨密度增加骨折的风险[11],产生肝毒性[12],还可造成肠道功能紊乱[13]。所以研究人员更倾向于利用草本植物和通过功能性食品调节膳食结构从而控制血糖。

沙棘多糖,沙棘果,沙棘叶提取物均有降血糖的功效[14-16],但对沙棘蛋白降血糖方面的相关研究较少。长期以来,饮食干预一直被认为是控制血糖的有效措施[17],一些研究表明,用大豆蛋白等植物蛋白替代动物蛋白来改善糖尿病患者的血脂异常,对脂质分布有有益的影响,并可减少糖尿病肾病的损伤[18]。本文通过动物实验进一步研究沙棘蛋白对2型糖尿病小鼠的降血糖作用及其机制,以期为利用沙棘蛋白开发保健品、药品的研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

60只雄性SPF级db/db糖尿病模型小鼠(47±2) g,12只雄性SPF级m/m正常小鼠(24±2) g 购于常州卡文斯实验动物有限公司;沙棘籽粕(蛋白含量20%～23%) 由完美康普高原特色植物研究中心提供;沙棘蛋白 由实验室制备(其蛋白含量为80%);二甲双胍 广州白云上天心制药股份有限公司;其他试剂 均为分析纯。

血糖仪及试纸条、德国罗氏活力血糖仪 罗氏诊断产品(上海)有限公司;电子天平 莆田市衡科仪器有限公司;中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;恒温振荡器 江苏金怡仪器科技有限公司;雷磁PHS-3EpH计 上海仪电科学仪器有限公司;自动定氮仪、HYP-308消化炉 上海纤检仪器有限公司;L-8900日立全自动氨基酸分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司;Waters高效液相色谱仪 美国Waters公司;冷冻干燥机 东莞布鲁斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘蛋白制备工艺 经超临界提取油脂后的沙棘籽粕超微粉碎80目过筛,料液比1∶5,75%乙醇浸洗2次,去掉醇溶性杂质。1∶9料水比,6 mol/L氢氧化钠调pH11.0碱提取3 h,2 mol/L盐酸调pH5.0酸沉0.5 h,去离子水水洗两次酸沉蛋白,除去盐分,冷冻干燥(-45 ℃、9 Pa、24 h)得沙棘蛋白,4 ℃保存备用[6]。

1.2.2 沙棘蛋白含量的测定 总蛋白含量测定:采用凯氏定氮法[19],参照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》。

称取0.25 g左右的冻干沙棘蛋白于消化管中,加入10 mL浓硫酸和10 g催化剂,高温自动消化炉上450 ℃消化2 h至澄清透明,冷却后用自动定氮仪测定蛋白含量。

1.2.3 沙棘蛋白分子量的测定方法 采用凝胶色谱法测定肽分子量分布。检测条件:高效液相色谱(Waters 600),TSK gel G2000SWXL 凝胶色谱分析柱;检测波长为 220 nm;检测时间30 min;有机流动相(乙腈∶水=20∶80,加入0.1%的三氟乙酸),流速0.5 mL/min。将样品用上述流动相稀释,过0.22 μm滤膜,进样体积为20 μL,进行分析。

标准肽样品:抑肽酶(6500 Da),牛血清蛋白(68000 Da),gly-gly-tyr-arg(451 Da),双甘氨肽(132 Da),细胞色素C(12500 Da),杆菌肽(450 Da)。将出峰时间与标准品相对分子质量的对数值进行线性拟合,得到拟合方程y=-3.2389x+26.438(R2=0.9967),其中y为出峰时间,x为标准品相对分子质量的对数值。

1.2.4 沙棘蛋白氨基酸组成的测定 按GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》对冻干样的水解氨基酸进行测定,略作修改[20-21]。

水解氨基酸的测定:样品用6 mol/L盐酸于110 ℃下水解24 h,水解后定容至50 mL,针管吸取约1 mL,0.22 μm滤膜过滤后装入1 mL进样瓶中由氨基酸自动分析仪进行测定。

1.2.5 沙棘蛋白中金属含量的测定 采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS),参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[22]。

1.2.6 模型小鼠的分组及灌胃处理方案 将db/db模型组随机分为5组,m/m为正常对照组(Normal controls,NC),对小鼠进行耳号标记。进行灌胃实验,灌胃时间为8周,给予普通饲料,饮用水为无菌纯净水,每次灌胃均为无菌纯净水0.5 mL。

第一组为m/m小鼠的正常对照组(NC);第二组为db/db小鼠2型糖尿病未治疗对照组(DC),每日灌胃等量生理盐水;第三组为db/db小鼠阳性对照组(PC),每日灌胃300 mg/kg盐酸二甲双胍悬浮液;第四组为db/db小鼠沙棘蛋白高剂量组(SSPH),第五组为db/db小鼠沙棘蛋白中剂量组(SSPM),第六组为db/db小鼠沙棘蛋白低剂量组(SSPL)，高中低剂量组每日灌胃沙棘蛋白分别为:200、100、50 mg/kg。

1.2.7 小鼠检测指标

1.2.7.1 小鼠精神状态的观察、一级体重和血糖的测定 观察小鼠的精神活动,毛发和饮食饮水情况,记录小鼠适应性喂养1周后的初始体重W-0,以及灌胃1、4、8 w体重变化。

测量小鼠初始随机血糖W-0,以及灌胃1、4、8 w后禁食8 h的空腹血糖,小鼠尾静脉取血,用血糖仪和血糖试纸测定。

1.2.7.2 口服糖耐量实验 口服糖耐量实验(oral glucose tolerance tests,OGTTs)于实验8周后进行。各组动物禁食12 h后尾静脉取血测空腹血糖(FBG),之后给予相应的受试物,20 min后给予2.5 g/kg葡萄糖溶液,测定各组0.5、1、2 h时的血糖值,根据如下公式计算血糖曲线下面积GAUC[23]。

GAUC0～0.5h=(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.25

GAUC0.5～2 h=(0.5 h血糖+1 h血糖×3+2 h血糖×2)×0.25

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 沙棘蛋白肽分子量、氨基酸和金属含量

2.1.1 沙棘蛋白和肽分子量分布和氨基酸含量 经过碱溶酸沉处理得到的沙棘蛋白,其蛋白质含量为80%。由沙棘蛋白的肽分子量可知,沙棘蛋白组分中>10 kDa组分占26.14%,5～10 kDa组分占40.91%,1～5 kDa组分占17.95%,<1 kDa组分占15.00%,结果见表1。与其他植物蛋白,如大豆蛋白、玉米蛋白等相比[24],沙棘蛋白的溶解性较差,沙棘蛋白分子量明显较小。

表1 沙棘蛋白肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of seabuckthorn seed protein peptide

图1 沙棘蛋白肽分子量LC谱图Fig.1 LC spectrum of the molecular weight of seabuckthorn seed protein peptide

由沙棘蛋白氨基酸分析结果可知,沙棘蛋白中氨基酸组成比较丰富,含有17种氨基酸,包括7种必需氨基酸(色氨酸被酸水解破坏,未测定),必需氨基酸(含胱氨酸和酪氨酸)总量为其氨基酸总量的21.16%。沙棘种仁蛋白中氨基酸总量为66.379%,与凯氏定氮结果接近。

表2 沙棘蛋白的氨基酸含量分析(g/100 g)Table 2 Content of amino acids in seabuckthorn seed protein(g/100 g)

其中,谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较高,分别为22.30%、15.37%和11.25%。精氨酸是维持婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸。它也是精子蛋白的主要成分,有促进精子生成,提供精子运动能量的作用。此外,静注精氨酸,能刺激垂体释放生长激素,可用于垂体功能试验[25],因此沙棘蛋白可用于研发富集精氨酸的肽。研究表明,精氨酸调控NO在体内的合成,使得细胞具有足够的抗氧化活性,同时富含精氨酸的膳食可以调节胰岛细胞活性,增强GLUT4转运子活性从而调节血糖水平,降低由于高血糖引起的心血管疾病,这是沙棘蛋白降血糖活性的物质基础[26]。

2.1.2 沙棘蛋白金属元素含量 由表3可知沙棘蛋白中铅、砷、镉、总汞、铬等重金属含量都远远低于国家标准要求[27],碱提酸沉钠含量较高。锌是300多种酶保持活性的必需微量元素[28],且锌元素与甲状腺功能密切相关[29]。血液中硒、铜、镁、铁、锌等多种元素失衡的状态容易增加代谢综合征的风险[30],沙棘蛋白中铜、镁、铁、钠、锌、硒含量丰富,能够补充人体所需微量元素,发挥预防代谢综合征的作用。

表3 沙棘蛋白金属元素含量Table 3 Contents of metal elements in seabuckthorn seed protein

2.2 沙棘蛋白改善二型糖尿病效果评价

2.2.1 小鼠一般状态的观察 正常组小鼠精神状态活跃,饮食饮水正常,便尿量正常,体重稳定增长。糖尿病未治疗组(DC)饮食饮水明显增多,尿量多,眼神呆滞,毛发粗糙,甚至出现掉毛现象。糖尿病小鼠经二甲双胍和沙棘蛋白治疗后精神和饮食状态有所改善,毛发顺滑有光泽,垫料较为干燥。

2.2.2 沙棘蛋白对小鼠体重的影响 由图2可知,NC组小鼠体重呈稳定增长的状态,db/db各组的初始体重无显著性差异(P>0.05)。实验4周以后沙棘蛋白组体重及其增长速度都高于DC组,DC组较其他组出现了糖尿病多饮多食,体重增长缓慢的症状。实验8周后,小鼠体重显著低于PC和SSPH治疗组(P<0.05)。沙棘蛋白处理组中SSPH对小鼠体重增长影响最大。糖尿病导致小鼠体重下降的影响与以往研究的结果一致[8],这一结果表明,沙棘蛋白可减轻糖尿病对小鼠造成的多饮多食多尿,体重增长缓慢的不良影响。

图2 沙棘蛋白对糖尿病小鼠体重的影响Fig.2 The effect of seabuckthorn seed protein on the body weight of mice注:*表示与DC组相比有显著性差异,P<0.05;#表示与PC组有显著性差异,P<0.05;图3同。

2.2.3 沙棘蛋白对小鼠血糖的影响 由实验结果可知,NC组正常小鼠血糖值基本稳定在一定范围内,db/db糖尿病各组小鼠的初始随机血糖无显著性差异(P>0.05),灌胃一周后的空腹血糖也无显著性差异(P>0.05)。实验进行四周后DC组血糖达到峰值28.06 mmol/L,相比于DC组,其他治疗组血糖都显著性下降(P<0.05),SSPL组降糖效果最优。治疗8周后,与模型对照DC组的高血糖水平相比,沙棘蛋白在一定程度上抑制了糖尿病小鼠血糖的上升。实验数据显示小鼠血糖值未随着实验时间对沙棘蛋白呈现出一定的剂量依赖性,但是总体上与DC未治疗组相比,血糖水平保持在较低水平。沙棘蛋白SSPM组和SSPL组降血糖效果优于SSPH组,结果见图3。

图3 沙棘蛋白对二型糖尿病小鼠血糖的影响Fig.3 The effect of seabuckthorn seed protein on the glucose values of mice

2.2.4 沙棘蛋白对小鼠血糖曲线下面积GAUC的影响 OGTTs是一种葡萄糖负荷试验,用于了解机体对葡萄糖的调节和耐受性[31]。口服葡萄糖耐量试验中的空腹血糖(FBG)主要反映夜间基础胰岛素的作用,餐后血糖是饮食作用后的反应,两者都需要综合分析[32]。此外血糖曲线下面积是一种反应血糖水平的指标,相较于单点的血糖值,血糖曲线下面积能更全面的分析血糖变化的时间和程度。由表4可知与FBG相比,血糖水平在0.5～1 h明显升高到,在1 h达到峰值,根据GAUC计算,比重最大的是餐后1 h血糖。经过2 h的调节,血糖水平下降到稳定状态。SSPL组在不同时间段血糖均显著低于DC组(P<0.05)。NC组、PC组、SSPL组与DC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明,沙棘蛋白能明显控制糖尿病小鼠的血糖,增强其调节血糖的能力,增强小鼠对血糖的耐受性。由表4可知,正常组NC的0～0.5 h血糖曲线下面积和0.5～2 h血糖曲线下面积显著低于糖尿病组(P<0.05),糖尿病组DC的血糖曲线下面积显著高于治疗组(P<0.05),三个剂量组的沙棘蛋白的曲线下面积无显著性差异(P>0.05),结果可知,沙棘蛋白可以提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,减少葡萄糖的吸收。

表4 血糖曲线下面积(GAUC)Table 4 Blood glucose area under curve(GAUC)

3 结论

含量80%的沙棘蛋白氨基酸总量为66.379%,精氨酸含量较高,约占15.37%。沙棘蛋白含有人体所需的铜、镁、铁、钠、锌、硒等多种金属元素。实验证明沙棘蛋白低剂量组(50 mg/kg)对糖尿病小鼠降血糖效果最明显;通过血糖曲线下面积可知,沙棘蛋白可明显提高糖尿病小鼠的葡萄糖敏感性,减少葡萄糖的吸收。沙棘蛋白能有效降低糖尿病小鼠的血糖和改善小鼠的精神状态,减轻糖尿病对小鼠的损伤。