响应面法优化水溶性虎奶菇多糖提取工艺及其对胃癌细胞的抑制作用

徐军军,李治堃,黄飞龙,王梦楠,陈星光,席慧婷,邓丹雯,黄赣辉,*

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学玛丽女王学院,江西南昌 3300473.江西辉瑞制药有限公司,江西南昌 330100)

虎奶菇,是一种子实体和菌核均可食用的珍稀食用兼要用真菌[1],主要分布在我国云南省、印度、印度尼西亚及马来西亚等国,含有丰富的蛋白质、多糖等活性成分[2-3],其生物活性值得广泛关注。

近年来天然提取物的抑癌研究备受中外学者青睐,从天然产物中探索出安全有效的抗肿瘤成分成为研究热点。研究表明,海带[4]、鱼腥草[5]、乌头[6]、红花[7]中的提取的多糖均具有一定的抑癌效果。菇类菌核多糖也具有多种生物活性,霍宗庆[8]等从白玉菇中提取多糖,并利用单因素和响应面法优化其提取工艺,最优参数为提取温度80 ℃、提取时间4.2 h、料液比1∶35,在此条件下提取白玉菇多糖的得率为6.41%。贾毓宁等[9]对猴头菇多糖提取条件进行优化,并发现其多糖具有良好的抗氧化性。Mei Zhan等[10]将虎奶菇菌核中6种非水溶性虎奶菇菌核多糖硫酸化之后得到S-TM8,具有明显的抗病毒效果。陶永真等[11]从虎奶菇菌核中提取出一种水溶性葡聚糖,并制备其硫酸酯衍生物,证实该衍生物具有体内抗肉瘤S-180活性及体外抗肝癌HepG2活性。目前,国内外对虎奶菇的报道主要集中在栽培及品种改良等方面,其水溶性菌核多糖的提取工艺优化很少有过报道。

本研究利用水提、醇沉法提取水溶性虎奶菇菌核多糖,经Sevage除蛋白、透析、冷冻干燥获得精多糖,并利用单因素和响应面优化其提取条件;以胃癌细胞SGC-7901为研究对象考察该多糖体外抗胃癌活性,通过WST-1细胞增殖检测试剂盒以及流式细胞术研究不同浓度的该多糖溶液对胃癌细胞增殖率和早期凋亡的影响,为后续探究虎奶菇抗胃癌活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

虎奶菇菌核 江西省抚州市临川金山食用菌专业合作社提供,用PBS溶解,配制储存液浓度为1.25 mg/mL;葡萄糖系列标准品 中国科学计量所;RPMI-1640细胞培养基、青链霉素、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索莱宝科技有限公司;WST-1和Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司;无水乙醇、硫酸 上海振兴化工一厂;苯酚 北京索莱宝科技有限公司;人胃癌细胞株SGC-7901 武汉普诺赛生命科技有限公司提供,培养传代于含10%胎牛血清、1%的双抗(青霉素+链霉素)RPMI-1640 培养基中,置于 5% CO2、37 ℃ 恒温培养箱,选取对数生长期的细胞进行实验。

高效液相色谱仪 Waters公司;722N型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;FACS Calibur TM流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司;Varioskan Flash多功能酶标仪 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的提取工艺 虎奶菇破碎至直径为2 cm左右的颗粒,烘干过40目筛,于95%的乙醇溶液中浸泡12 h,除去虎奶菇菌核中的脂溶性杂质。称取一定质量的虎奶菇粉末,按照一定的料液比与蒸馏水混合,90 ℃水浴中提取一定时间。收集合并滤液,用旋蒸仪在60 ℃进行浓缩,至原体积的十分之一时,以体积比(溶液∶95%乙醇溶液)=16∶3的比例沉淀多糖,4800 r/min离心15 min,得到粗多糖。

取适量粗多糖溶液用Sevage法进行脱蛋白,4800 r/min离心15 min,重复上述操作一次,上清液分别在自来水中透析2 d,蒸馏水中透析1 d。浓缩透析液,冷冻干燥即得到虎奶菇纯化多糖。

1.2.2 单因素实验 分别研究料液比、提取时间、提取温度对虎奶菇菌核多糖得率的影响。主要包括以下步骤,称取同一批次的虎奶菇20 g,分别设置不同的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)在90 ℃水浴条件下提取2.5 h;料液比为1∶25 g/mL,在90 ℃水浴条件下提取不同时间(1、2、3、4、5 h);料液比为1∶25 g/mL在不同提取温度(60、70、80、90、100 ℃)条件下提取4 h,按1.2.1提取工艺进行操作,测定各组菌核粉末多糖得率。

1.2.3 响应面试验 根据单因素实验结果,选择料液比(A)、提取温度(B)、提取温度(C)作为自变量,以虎奶菇菌核多糖得率(Y)作为响应值,采用Box-Benhnken的中心组合实验设计响应曲面法对水溶性虎奶菇菌核多糖提取条件进行优化分析。

表1 响应曲面因素水平编码表Table 1 Factors and levels coding of response surface

1.2.4 虎奶菇纯化多糖得率的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法[12-13]。准确称取100 mg葡萄糖标准品，用去离子水溶解，定容到100 mL，制备成1 mg/mL的标准葡萄糖溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准葡萄糖溶液，用去离子水定容到10.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL浓硫酸，振摇，静置30 min在490 nm处测定各溶液的吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横轴，吸光度为纵轴绘制标准曲线。得葡萄糖标准曲线为y=8.7146x+0.0143(R2=0.999)，其中x为多糖浓度(以葡萄糖计；mg/mL)，y为所多糖的吸光度。

1.2.4.2 虎奶菇纯化多糖的测定 称1.0 g纯化多糖溶于100 mL去离子水配制成多糖待测液，取0.5 mL多糖待测液，用去离子水定容至10 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL浓硫酸，振摇，静置30 min在490 nm处测定其吸光度，并根据葡萄糖标准曲线计算待测液的纯化多糖的浓度。

1.2.4.3 虎奶菇纯化多糖得率的计算 根据公式计算虎奶菇纯化多糖的得算公式如下：

式(1)

1.2.5 细胞增殖实验 取对数生长期人胃癌细胞株SGC-7901细胞接种到96孔板中,每孔加入100 μL(约6×103个细胞)的 RPMI-1640细胞培养基(含10%胎牛血清、1% 的双抗)。待细胞贴壁后,弃掉原培养基,实验组中加入用RPMI-1640 细胞培养基稀释虎奶菇菌核储备液而成的不同浓度虎奶菇菌核多糖溶液(终浓度分别为3.0、7.5、15、30、60、125、250、500 μg/mL),阴性对照组中加入等体积的PBS作为空白对照,每组设定6个复孔,置于恒温培养箱中孵育24 h。然后向每孔加入10 μL WST-1溶液,继续在恒温箱中孵育1.5 h,孵育结束后将96孔板置于摇床上摇动1 min以充分混合待检体系,用酶标仪于450 nm处测量吸光(OD)值[15]。按式(2)计算虎奶菇菌核多糖对胃癌细胞SGC-7901的增殖率(θ):

式(2)

式中:OD1和OD2分别为阴性对照组和试验组的吸光值。

1.2.6 细胞凋亡影响试验-Annexin V-FITC/PI双荧光染色法 取对数生长期人胃癌细胞株SGC-7901细胞接种到6孔板中,每孔加入1 mL(约6×105个细胞)的RPMI-1640完全培养基,过夜,待细胞贴壁后,弃掉原培养基,加入含有不同质量浓度样品的RPMI-1640完全培养基1 mL(分别为0、20、50和100 μg/mL),等体积的PBS作为阴性对照组,恒温培养箱中培养24 h。到达孵育时间后用预冷PBS洗涤细胞2～3遍,每孔加入200 μL不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化细胞,2 min后加入1 mL完全培养基终止消化,然后将细胞轻柔的吹打下来,混匀后转移至离心管内,1500 r/min离心5 min,弃去上清液,加1 mL PBS重悬细胞,1000 r/min离心5 min除去残留培养基,弃上清液后加入500 μL的结合液重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide,混匀,室温下避光反应15 min,在1 h内进行流式细胞仪检测[14]。

1.3 数据处理

根据Design-Expert 8.0.6软件,设计响应面实验方案,实验数据采用软件SPSS 19.0进行方差分析并用OriginPro 8.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对多糖得率的影响 如图1所示,料液比在1∶10～1∶25范围内,水溶性虎奶菇菌核多糖得率随料液比的增加而增大,料液比为1∶25时多糖得率达到2.15%,当料液比增加到1∶30时,得率没有明显的增加,这是因为当料液比过高,溶出性杂质会增加,抑制多糖溶解,考虑到经济性原则[13],因此选择最佳料液比为1∶25。

图1 料液比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on yield of polysaccharide

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响 如图2所示,随着提取时间的增加多糖得率逐渐增加,当提取时间达到4 h时得率达到2.49%。继续增加提取时间,多糖得率呈下降趋势,这可能是因为提取时间过长会导致其他可溶性杂质溶出,导致溶液黏度增加,抑制多糖溶解[15-16],因此确定最佳提取时间为4 h。

图2 提取时间对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide

2.1.3 提取时间对多糖得率的影响 如图3所示,在提取温度在60～90 ℃时,多糖得率随提取温度的升高明显增加,在90 ℃使得到最大值,当继续增加提取温度得率下降,这可能是因为高温提取条件使虎奶菇菌核多糖的结构遭到破坏,导致多糖溶出受阻[16],因此选择90 ℃为最佳提取温。

图3 提取温度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of polysaccharide

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面模型建立及显著性检验 响应面的实验方案及结果见表2,方差分析见表3。采用软件Design-Expert 8.0.6进行多元回归拟合,得到多糖得率(Y)对各项因素的二次多项回归方程为:Y=-19.98+0.43A+2.22B+0.24C-0.024AB+1.15×10-3AC-5.25×10-3BC-8.04×10-3A2-0.136 B2-1.335×10-3C2。由表3可知,模型F值为2634.73,P<0.0001,说明模型具有显著性;失拟项F为3.75,P>0.05,说明失拟项差异不显著,试验无失拟因素存在,相关系数R2=0.9993,表明该模型具有极显著的统计学意义,误差较小,拟合度好,适用于虎奶菇菌核多糖提取工艺的优化。其中,料液比、提取时间、提取温度及其之间的交互作用对虎奶菇菌核多糖的提取均具有显著影响。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表2 响应面实验方案及结果Table 2 Response surface experimental scheme and results

2.2.2 响应面分析 图4显示了各因素及其交互作用对水溶性虎奶菇菌核多糖得率的影响,曲面图反映多糖得率的大小。由图可知,两个因素的等高线均呈椭圆形,说明两个因素之间的交互作用显著。图4(a)表明当时间在3.50～4.50 h之间,液料比在24～30 mL/g之间时,多糖得率最大;图4(b)表明当温度在90～100 ℃之间,液料比在26～28 mL/g时,多糖得率最大;由图4(c)得当温度在90～100 ℃样品之间,时间在3.5～4.5 h时,多糖得率达到最大。

图4 两因素交互作用对多糖得率的影响响应面Fig.4 Response surface and contour map of the interaction on the extraction rate of polysaccharides

根据响应面优化结果,得到最佳提取工艺预测值:液料比为28.52 mL/g,时间为3.77 h,温度为98.07 ℃时,多糖得率达到2.62%±0.3%。根据实际操作性将最佳工艺更正为以液料比28.0 mL/g,时间3.5 h,温度98 ℃对多糖得率的最佳工艺进行验证,试验重复三次取平均值,得到多糖得率为2.59%±0.5%,与预测值接近,说明本模型预测多糖得率可靠,具有可行性。

2.3 体外抗SGC-7901胃癌细胞活性

2.3.1 虎奶菇菌核多糖对胃癌细胞增殖率的影响 图5显示了胃癌细胞SGC-7901的增殖率随培养基中多糖浓度的变化趋势,当多糖浓度小于30 μg/mL时,多糖对细胞增殖没有抑制作用。相反,多糖作为碳源,促进了细胞的增殖。当多糖浓度达到15 μg/mL,细胞增殖开始受到抑制,当浓度达到60 μg/mL及以上时,细胞增殖率与多糖浓度呈显著负相关,虎奶菇菌核多糖浓度为500 mg/mL时对胃癌细胞SGC-7901的抑制率达到了30.3%,说明水溶性虎奶菇菌核多糖对胃癌细胞SGC-7901的增殖具有一定的抑制作用。

图5 药物浓度对于细胞增殖率的影响Fig.5 Effect of drug concentration on cell proliferation注:*表示与空白对照具有显著性差异(P<0.05)。

2.3.2 水溶性虎奶菇菌核多糖对胃癌细胞早期凋亡的影响 将胃癌细胞SGC-7901分别在多糖浓度为0、20、50和100 μg/mL的培养液中培养24 h,Annexin V-FITC/PI双荧光染色处理后,流式细胞仪检测结果如图6所示,图中的每个点代表一个特定染色状态的细胞,其中右上象限的点表示Annexin+/PI+的坏死或晚期凋亡细胞,右下象限的点表示Annexin+/PI-的早期凋亡细胞。胃癌细胞SGC-7901经不同浓度多糖作用24 h后,总细胞数中处于早期凋亡的细胞比例随着培养液中多糖浓度的增加逐渐升高。这说明水溶性虎奶菇菌核精多糖具有促进胃癌细胞SGC-7901早期凋亡的作用,且其功效随浓度的升高而增大。

图6 不同浓度下Annexin V-FITC和PI染色后流式细胞仪检测细胞早期凋亡效果图Fig.6 Flow cytometry after Annexin V-FITC and PI staining at different concentrations to detect early apoptosis effect注:a～d图对应的多糖浓度为分别为0,20,50,100 μg/mL。

3 结论与讨论

本研究通过单因素和响应面实验优化提取未经纯化的水溶性虎奶菇菌核多糖,确定最佳工艺条件:料液比1∶28 g/mL,提取时间为3.5 h,提取温度为98 ℃,在此条件下虎奶菇菌核多糖的得率为2.59%±0.5%。细胞实验表明,水溶性虎奶菇菌核多糖的浓度对SGC-7901细胞增殖具有抑制效果,并且随着多糖浓度的增加,抑制效果越明显。当多糖浓度为500 mg/mL时,对胃癌细胞的抑制率达到30.3%。

研究表明,白藜芦醇、藤黄酸等通过诱导Bax、抑制BcL-2的基因表达实现细胞凋亡,从而达到抗癌效果[17-18];香菇多糖也是通过增强促凋亡因子Bax的表达、抑制抗凋亡因子BcL-2的表达来诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞BGC-823的增殖[19-20]。水溶性虎奶菇菌核多糖诱导细胞凋亡的机理是否也遵循这一机理,尚需进一步研究证实。