QuEChERS高效液相色谱串联质谱法检测奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物

谢瑜杰,陈 辉,胡雪艳,刘志楠,范春林,呼秀智,彭 涛,*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.河北工程大学生命科学与食品工程学院,河北邯郸 056021)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZON)又称F-2毒素,是由镰刀菌属产生一种毒素,广泛存在于饲料和农产品等基质中,尤其在潮湿地区,玉米赤霉烯酮更易存在于农产品等基质中[1-2]。该毒素具有弱的雌激素作用,人和动物摄入被玉米赤霉烯酮污染的食物或饲料后会造成生殖系统机能紊乱,且经胃肠道消化后可代谢产生毒性更强的代谢物(代谢途径见图1),严重时可能造成死亡[2-4]。排出体外的玉米赤霉烯酮通过水和食物会造成第二次污染,人食用后会抑制促性腺激素结合受体,影响人体性机能及第二性征,在外部条件诱导下还会致癌[5-6]。研究发现,该毒素可通过血-乳屏障进入到牛乳中,导致乳及乳制品中会有玉米赤霉烯酮的残留[7-8]。随着经济发展及生活水平的提高,乳及乳制品已成为居民获取营养物质的重要来源,而奶粉作为婴幼儿等免疫力低下人群营养物质的主要来源,其质量安全问题更应被重视,尤其对于玉米赤霉烯酮等对人体危害极大的真菌毒素的污染。

图1 玉米赤霉烯酮在体内代谢途径Fig.1 Metabolic pathway of zearalenone in vivo

由于玉米赤霉烯酮具有毒性,我国食品安全国家标准食品中真菌毒素限量(GB 2761-2017)[9]中规定玉米赤霉烯酮在小麦等谷物及其制品中限量指标≤60 μg/kg,但并没有相关组织对奶粉中玉米赤霉烯酮的残留限量制定相关规定。因此,为了保障消费者食用产品的安全及个人健康,研究建立能够简单、快速、灵敏、高效地检测奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的方法就显得尤为重要。针对检测食品中玉米赤霉烯酮的方法很多,如ELISA[10]、气相色谱-质谱法[11]、高效液相色谱法[12]、高效液相色谱串联质谱法[13]等。目前主要采用的是高效液相色谱串联质谱法。高效液相色谱串联质谱法具有灵敏度高、稳定可靠、定性定量准确等优势,使其成为检测玉米赤霉烯酮的常用检测方法[13-14]。截至目前,HPLC-MS/MS常用来检测粮油和谷物中玉米赤霉烯酮及其代谢物[15-19],很少应用于婴幼儿食品的检测,其中Zöllner等[17]使用高效液相色谱串联质谱检测早餐谷物和婴儿食品中玉米赤霉烯酮等真菌毒素,其中玉米赤霉烯酮的检出限是10 μg/kg。但使用HPLC-MS/MS检测奶粉中的玉米赤霉烯酮及其代谢物目前尚未报道。

目前,用于奶粉中兽药及激素残留的净化方法主要有固相萃取柱净化[20-21]、磁性多壁碳纳米管分散固相萃取[22]、分子印迹固相萃取[23-24]等,这些传统方法在净化技术上有选择性好,抗干扰能力强等特点,但与QuEChERS净化方法相比,存在操作繁琐且耗费高的缺点。近年来,改进和优化后的QuEChERS方法应用在多种基质的农兽药及真菌毒素的残留检测中[25-26],但针对净化奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物并未见报道。

本研究对奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的分析方法进行研究。为了更好地提取目标物,本研究在加入提取液前先加入适量的水增加分散性,使用乙酸钠作为盐析剂,促使目标物更好地提取。此外,对传统的QuEChERS方法进行优化和改进。建立了改进的QuEChERS净化结合高效液相色谱串联质谱法检测奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的方法,并对该方法的检出限、定量限、精密度、基质效应和回收率进行了验证。方法简单快速,灵敏度高,结果可靠准确,可以为准确快速检测奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奶粉诺优能 物美超市购买;α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇-d7标准溶液(10 mg/L) 德国Dr.E公司,纯度≥97%;乙腈色谱纯、正己烷色谱纯、乙酸质谱级 Fisher公司;乙酸铵色谱纯 Acros Organics 公司;C1850 μm 天津博纳艾杰尔公司;氧化锆包覆硅胶(Z-Sep) Sigma-Aldrich公司;N-丙基乙二胺(PSA) 40～60 μm,天津博纳艾杰尔公司;实验用水 为Milli-Q超纯水;其它未做说明的试剂 均为分析纯。

Agilent 1290高效液相色谱仪和Agilent 6460三重四极杆质谱仪 美国安捷伦公司;TRIO TM-1 N型漩涡混合器 AS ONE公司;SR-2DS型水平振荡器 TATEC公司;3-30 K型高速冷冻离心机 Sigma公司;N-EVAP 112型氮吹仪 Organomation Associates公司;Milli-Q超纯水仪 Millipore公司;KQ-600B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 配制标准溶液 精确称取各标准品0.01(精确至0.0005 g),分别置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成质量浓度为1000 mg/L的标准储备液,于4 ℃冰箱保存。需要时各取储备液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中,并用甲醇稀释成10 mg/L的混合中间液,使用前将中间液用甲醇稀释配制成1.0 mg/L的混合标准液。配制好的溶液均避光、4 ℃下保存。

β-玉米赤霉烯醇-d7标准溶液(10 mg/L)内标溶液(甲醇中)在使用前稀释至1 mg/L。

1.2.2 奶粉中玉米赤霉烯酮类化合物提取 准确称5.00 g奶粉样品(超市购买)置于50 mL离心管中,加入1 mg/L内标20 μL,涡旋20 s,静置20 min,加入10 mL超纯水涡旋混匀,再分别加入10 mL 1%乙酸乙腈和2 g乙酸钠,快速摇匀,涡旋1 min,10000 r/min离心10 min,取上清液于50 mL离心管中。用1%乙酸乙腈重复提取1次,合并上清液。

1.2.3 除脂 将1.2.3的提取液加入乙腈饱和正己烷10 mL,涡旋20 s,10000 r/min离心5 min,弃上层正己烷,用1%乙酸乙腈定容至20 mL,待净化。

1.2.4 净化 将1.2.4溶液取10 mL转移至装有60 mg C18、60 mg PSA、100 mg无水硫酸镁的15 mL离心管中,水平振荡10 min,10000 r/min离心10 min,取上清液于另一试管中,在40 ℃下氮吹至干,以1 mL水-乙腈(3+1,v/v)定容,过0.22 μm滤膜后,供HPLC-MS/MS分析。

1.2.5 测定条件

1.2.5.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm);柱温:40 ℃;流速:0.4 mL/min;进样量:10 μL;流动相:A为5 mmol/L NH4Ac溶液,B为乙腈溶液;洗脱梯度:0～5 min,25%～70% B,5～6 min,70% B;6～9 min,70%～25% B。

1.2.5.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)负离子模式;多反应监测(MRM);毛细管电压;4.0 kV;源温度:350 ℃;去溶剂气流:氮气,10 L/min;去溶剂温度:325 ℃;锥孔气流:氮气,8 L/min;碰撞气压:氮气,0.4 MPa。其他参数见表1。

表1 玉米赤霉烯酮及其代谢物的质谱分析参数Table 1 Mass spectrumparamenters for zearalenone and its metabolites

1.3 数据处理

采用Excel和Origin 8.5进行数据处理,结果采用形式表示。

2 结果与分析

2.1 提取方式的优化

称取5 g样品,在10 μg/kg添加浓度下,加入10 mL水及10 mL提取液与直接加入10 mL提取液的回收率进行对比。发现直接加入提取液的样品回收率除β-玉米赤霉醇外,其他目标物均低于70%,而水化后所有目标物均有明显提高,均高于80%,如图2所示。考虑其原因为奶粉是一种干粉样基质,同时具有一定的水溶性,为了能将奶粉中目标物更完全地提取出来,本实验选择在加入提取液前加入适量的水,以增加分散性,提高玉米赤霉烯酮及其代谢物的提取效率[27]。

图2 在10 μg/kg添加浓度下水化对玉米赤霉烯酮及其代谢物回收率的影响Fig.2 Effect of hydration on recovery of ZERs at 10 μg/kg concentration

奶粉属于高脂、高蛋白样品。研究表明,乙腈具有沉淀蛋白的作用[28],同时,玉米赤霉烯酮及其代谢物呈弱酸性,在酸性条件下易于有机溶剂提取,且根据前期实验检测牛奶中玉米赤霉烯酮类毒素,发现使用1%乙酸乙腈作为提取液提取效果最好[29],回收率在70%～120%之间,因此,本实验选择1%乙酸乙腈作为提取奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的提取液。

2.2 净化方法的优化

鉴于玉米赤霉烯酮及其代谢物在食品中含量甚微,但干扰物质甚多,因此净化便成为去除干扰物的关键步骤[30]。一般净化方式主要有固相萃取、免疫亲和柱净化、液-液分配、基质分散固相萃取等技术。本实验选择使用液-液分配和QuEChERS两步净化方法消除奶粉中干扰物质的影响。

首先使用乙腈饱和正己烷去除奶粉中大部分脂肪。本实验对比了乙腈饱和正己烷的使用次数,在提取液与乙腈饱和正己烷体积相同的情况下,发现随着乙腈饱和正己烷的使用次数的增多,净化效果越好,但是目标化合物的回收率也会随之降低,为了兼顾净化效果以及回收率,本实验选择使用一次乙腈饱和正己烷除脂。

其次,采用QuEChERS方法对除脂后的提取液进一步净化。常见的吸附剂中,C18可去除基质中的脂肪和酯类等[29],Z-Sep常被用于去除高脂肪蔬菜产品的提取物[31],PSA常用于去除脂肪酸、糖等极性物质[29],无水硫酸镁主要用来去除提取液中残留的水分[29]。本实验将10 mL提取液倒入装有吸附剂的15 mL塑料离心管中。吸附剂选择使用60 mg C18或60 mg Z-Sep分别结合60 mg PSA、100 mg无水硫酸镁在10 μg/kg添加浓度下进行对比,如图3所示。结果发现,在相同质量的PSA和无水硫酸镁的条件下,C18对目标物净化后的回收率影响较小,除β-ZOL外,其余目标物的回收率均高于80%,而使用Z-Sep净化后,除β-ZOL外,其余化合物的回收率均低于C18的净化结果,尤其是α-ZAL和ZON回收率仅有60%。因此本实验选择C18、PSA、无水硫酸镁三种吸附剂作为研究对象。

图3 在10 μg/kg添加浓度下C18和Z-Sep对玉米赤霉烯酮及其代谢物回收率的影响Fig.3 Effecting of C18 and Z-Sep on the recovery of ZERs at 10 μg/kg conteration

本文在10 μg/kg添加水平下对C18、PSA和无水硫酸镁的用量进行优化。选择200 mg C18和无水硫酸镁,分别使用40、60、80、100、150、200 mg的PSA对提取液进行净化,根据净化效果和净化后的回收率选取最佳的净化填料比例。图4(a)给出了PSA用量变化时6种目标物回收率的变化情况,当PSA用量为40 mg时,6种目标物的回收率相对较低,用量在80～200 mg时,除α-ZAL,α-ZOL,β-ZAL外,其余三种目标化合物的回收率随着用量的增多而上升,且RSD值也随之增大,而使用60 mg PSA时回收率和重复性结果均较其他用量时效果好;

当PSA用量为60 mg,无水硫酸镁用量为200 mg的时候,分别使用40、60、80、100、150、200 mg的C18对提取液进行净化,图4(b)给出了C18用量对目标化合物回收率的影响,可以看出当用量为60 mg时,除α-ZAL和β-ZAL外,其余4种目标物的回收率优于其他条件;

当PSA和C18用量均为60 mg时,分别使用40、60、80、100、150、200 mg的PSA对提取液进行净化,根据目标化合物的回收率及RSD,如图4(c)所示,当无水硫酸镁用量为100 mg时,除α-ZOL,β-ZOL和ZAN外,其余3种目标物的回收率和RSD最好。净化效果如图5所示,在最佳净化填料比例下,6种目标物在0.2 μg/kg添加浓度下,目标化合物的出峰位置无杂峰出现。因此,本文选择的吸附剂比例为C18+PSA+无水硫酸镁(60 mg+60 mg+100 mg)。

图4 在10 μg/kg添加浓度下吸附剂对回收率的影响Fig.4 Effec of adsorbent on the recovery at 10 μg/kg conteration注:a:PSA对回收率的影响;b:C18对回收率的影响;C:无水硫酸镁对回收率的影响。

图5 奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物TIC图Fig.5 TIC diagram of ZERs in milk powder注:1:β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇2:α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮;3:玉米赤霉烯酮。

2.3 色谱条件的选择

结合前期研究结果[26],发现玉米赤霉烯酮及其代谢物在C18色谱柱上可以很好的保留,因此本实验选择在ZORBAX SB-C18柱上分离。有研究报道,乙酸铵溶液作为流动相时,可以减少基质干扰和提高离子化效率[29],因此本实验选择使用乙腈和5 mmol/L乙酸铵作为检测奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的流动相。

2.4 基质效应的影响

为了考察基质效应,本试验建立了溶剂标准曲线和基质标准曲线,其浓度均为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/kg。通过比较两条标曲的斜率判定基质效应。具体计算公式如下:基质效应(ME,%)=(基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率)/溶剂标准曲线的斜率×100。根据受到基质效应的强弱,将基质效应分为三类:ME值低于-20%表现为基质抑制效应;ME值介于-20%和20%之间表现为弱基质效应;ME值高于20%表现为基质增强效应。结果如表2所示,所有目标化合物的基质效应均表现为基质抑制效应,为了降低基质的干扰,保证定量的准确性,本实验选择内标法进行测定。

表2 奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的基质效应Table 2 Matrix effect for zearalenone and its metabolites in milk

2.5 定量方式及线性关系

本文以β-玉米赤霉烯醇-d7为内标,以阴性奶粉样品提取液作为溶剂配制混合标准溶液,采用内标法定量,6种目标物的线性方程和相关系数如表3所示。在阴性样品中添加目标化合物,按照给定的方法测定,在0.1～50 μg/L线性范围以定性离子的信噪比S/N≥3对应添加水平作为检测限(LOD),定性离子的信噪比S/N≥10对应的添加水平作为定量限(LOQ),结果见表3。结果显示该方法的检出限为0.1 μg/kg,定量限为0.2μg/kg。

表3 玉米赤霉烯酮及其代谢物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear range,regression equation,correlation coefficient,LOD and LOQ of zearalenone and its metabolites

2.6 准确度和精密度

本实验为了考察方法的准确度和精密度,使用阴性奶粉为空白样品,分别选择LOQ的1倍、2倍和10倍浓度不同的玉米赤霉烯酮及其代谢物标准溶液作为添加量,按前述方法进行测定,每个浓度7个平行。同时做空白实验,均扣除本底值后计算添加回收率和相对标准差。6种目标物在奶粉中的添加回收率为85.2%～119.3%,RSD在0.3%～12.2%之间,符合方法学验证的要求,结果见表4。

表4 准确性和精密度实验结果(n=7)Table 4 Accuracy and precision of the method(n=7)

3 结论

本研究建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS对奶粉中玉米赤霉烯酮及其代谢物的检测方法。对提取方法、净化条件等方面进行优化,最终选取使用10 mL超纯水稀释,1%乙酸乙腈提取,60 mg PSA、60 mg C18和100 mg无水硫酸镁净化,HPLC-MS/MS检测,内标法定量。该方法具有简单、快速、灵敏度高,可推广用于动物性食品中玉米赤霉烯酮及其代谢物的检测。