外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的影响

刘凯歌，龚繁荣，宋云鹏，张丽丽

(上海市农业科学院设施园艺研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403)

甜椒(CapsicumannuumL.)营养丰富、色泽鲜艳，属于经济价值较高的温室作物之一，适宜生长温度为27—28℃，夏季持续高温常造成其植株生长不良和落花落果等现象[1]。 喷施外源物质作为一种提高植物抗逆性简便、高效的方法，受到越来越多的重视[2]。6-BA(6-苄基腺嘌呤)是一种较活跃的细胞分裂素，对于缓解生物和非生物胁迫有重要的作用[3]。关于6-BA调节植物胁迫的生理机制主要有以下几个方面：改善植物光合作用[4-5]，提高植物对光能的分配利用[6]；提高抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化程度，进而保护膜结构和功能的完整性[7]；提高渗透调节物质的积累[8]；提高植物体内ATP的含量，改善植物能量代谢失调[9]。目前，关于6-BA调控甜椒耐高温的生理机制鲜有报道。本试验以甜椒幼苗为材料，研究6-BA处理对高温胁迫下甜椒叶片叶绿素含量、叶绿素荧光参数、O-2· 产生速率、各种抗氧化酶活性以及MDA含量和相对电导率的影响，以期从光能的吸收、能量转换、电子传递以及抗氧化酶调节等方面明确6-BA提高甜椒幼苗抗高温胁迫的作用机制，为利用6-BA缓解高温胁迫对甜椒幼苗产生的危害提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料培养和处理

试验于2014年5月14日在上海市农业科学院玻璃温室内进行。供试甜椒P13201种子和光照培养箱均由上海市农业科学院提供，6-BA购自美国Sigma公司。种子经温水浸种后播于草炭、蛭石和珍珠岩组成的混合基质中。甜椒幼苗出土后进行日本山崎甜椒营养液和清水的隔天灌溉。生长温度控制在28℃18℃(昼夜)。当甜椒幼苗具有6—7片真叶时，挑选生长一致的植株，置于温度为28℃18℃(昼夜)、光照强度为30 000 lx、相对湿度为70%的光照培养箱中进行常温营养液栽培。培养2 d后将试验材料分为7组(每组10株)，选取其中3组喷施蒸馏水，另外3组喷施10 μmolL 6-BA[10]，剩余 1 组喷施蒸馏水后直接取样测定生长指标以及生理生化指标，喷施时间为每天早上8：00左右。常温处理3 d后，分别从喷施蒸馏水和6-BA的处理中各选1 组取样测定相应指标，然后把剩余2组喷施蒸馏水的处理分别置于常温(28℃18℃，昼夜)和高温(40℃30℃，昼夜)的光照培养箱中，喷施6-BA的2组也做同样处理，其他条件同上。处理7 d(高温处理4 d)后，分别对上述4组进行取样，测定相应指标。将上述处理进行编号：①常温喷施蒸馏水处理为 CK组；②常温喷施10 μmolL 6-BA处理为 S1组；③高温喷施蒸馏水处理为 S2组；④高温喷施10 μmolL 6-BA处理为S3组；每处理3次重复。

1.2 测定指标及方法

用直尺测定甜椒幼苗株高，用电子游标卡尺测定茎基部作为茎粗，用电子秤称取地上、地下部鲜重，然后105℃杀青15 min，置于75℃烘干至恒重后，称取地上、地下部干重。叶绿素含量参照Zhu等[11]的方法测定。叶绿素荧光参数采用PAM-2100便携式调制荧光仪(Walz，Effeltrich，Germany)测定，各荧光指标参考张永平等[12]的方法。电导率采用电导仪测定，将鲜样冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2次，用打孔器取样0.3 g，装入大试管，加入15 mL蒸馏水，抽气3次，室温摇动24h，测电导率S1，然后封口沸水浴25 min，冷却，平衡10 min后测电导率S2，同时测定蒸馏水电导率S0。相对电导率=(S1-S0)(S2-S0)×100%。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[13]，O-2·产生速率参考Wang等[14]的方法测定，SOD活性的测定参考Giannopolitis等[15]的方法，POD活性的测定采用Cakmak等[16]的方法，APX活性的测定采用Nakano等[17]的方法。

1.3 数据处理及分析

试验数据采用Excel 2003绘图，采用SPSS统计软件的独立样本t检验、单因素方差分析对数据进行分析，并使用Tukey法对数据进行多重比较。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗生长的影响

如表1所示， 试验处理3 d后，S1组和CK组间的甜椒幼苗各生长指标没有显著差异；处理7 d后，S1组甜椒幼苗各生长指标均显著高于CK组(除茎粗外)。高温处理导致甜椒幼苗各生长指标显著降低，S2组甜椒幼苗的株高、茎粗、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重相比CK组分别下降了25.7%、5.2%、57.3%、63.8%、12.8%、38.9%；喷施10 μmolL 6-BA可以明显缓解高温造成的伤害，S3组甜椒幼苗各生长指标相比S2组显著升高，其株高、茎粗、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重分别增加了34.7%、5.3%、 113.9%、 143.3%、19.9%、 110.6%。由此可知，常温下喷施10 μmolL 6-BA对甜椒植株并没有胁迫作用，且在处理7 d后对植株的生长有明显的促进作用。高温阻碍了甜椒植株的生长，10 μmolL 6-BA处理可明显缓解高温造成的伤害。

表1 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗生长的影响

注：数据为平均值±标准差，相同处理时间同列数据后*或不同字母表示差异达5%显著水平，下同

2.2 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶片叶绿素含量的影响

如表2所示，S1组较CK组甜椒幼苗叶片叶绿素a含量略有上升，但差异不显著，叶绿素b含量显著下降，总叶绿素含量(叶绿素a+b)无显著差异，说明常温喷施10 μmolL 6-BA对甜椒植株的光能吸收没有显著影响。处理7 d后，S2组甜椒幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量大幅下降，相比CK组分别下降了66.0%、41.5%和62.3%。喷施10 μmolL 6-BA可以明显缓解叶绿素含量的降低，相比S2组，S3组甜椒幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量分别上升了 103.3%、 106.9%和 104.2%。可见，高温导致甜椒幼苗叶片叶绿素含量显著下降，而10 μmolL 6-BA可缓解叶绿素含量的降低，从而维持正常的光合作用和甜椒幼苗的正常生长。

表2 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶片叶绿素含量的影响

2.3 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

由图1可知，试验处理3 d后，相比CK组，S1组甜椒幼苗叶片叶绿素荧光参数FvFm、Yield、φPSII、NPQ无显著差异；处理7 d后，S1组甜椒幼苗叶片叶绿素荧光参数Yield、φPSII、NPQ与CK组差异显著，FvFm与CK组无显著差异；高温处理导致甜椒幼苗叶片叶绿素荧光参数FvFm、Yield、φPSII显著降低，NPQ显著升高，其中叶绿素荧光参数FvFm、Yield、φPSII分别下降了40%、39.2%、28%，NPQ升高了34.9%；喷施10 μmolL 6-BA可以明显缓解这一状况，相比CK组，S3组甜椒幼苗叶片叶绿素荧光参数FvFm、Yield、NPQ无显著差异，φPSII显著升高，相比S2组，其叶绿素荧光参数FvFm、Yield、φPSII、NPQ存在显著差异，其中FvFm、Yield、φPSII分别升高了59.8%、62.8%、68%，NPQ下降了23.6%。可见，高温严重降低了甜椒幼苗叶片叶绿素的光能利用率，而喷施10 μmolL 6-BA能明显缓解这一状况。

2.4 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶片超氧阴离子和抗氧化酶活性的影响

如图2A所示，试验处理3 d和7 d后，S1组甜椒幼苗叶片的O-2· 产生速率和CK组相比略有下降，但差异不显著；处理7 d后，高温导致甜椒幼苗叶片的O-2· 产生速率显著升高， S2组相比CK组O-2· 产生速率升高了90.4%。喷施10 μmolL 6-BA可明显缓解甜椒幼苗叶片O-2· 产生速率的升高，S3组与CK组无显著差异，较S2组O2-·产生速率显著下降了51.4%。由图2B、C、D可见，处理3 d和7 d后，S1组甜椒幼苗叶片SOD、POD、APX酶活性显著高于CK组；处理7 d 后，S2组甜椒幼苗叶片SOD酶活性显著低于CK组，但其POD和APX酶活性有所升高，其中POD酶活性显著升高。S1组较S2组甜椒幼苗叶片的SOD、POD、APX酶活性分别提高了37.2%、20.6%、19.1%。由此可知，高温导致甜椒幼苗叶片的O-2· 产生速率升高，使其受到胁迫伤害，而喷施10 μmolL 6-BA可有效增加SOD、POD、APX酶活性，以清除O-2· 的产生，从而缓解植物受到的胁迫伤害。

2.5 外源6-BA对高温胁迫下甜椒幼苗叶片MDA含量和相对电导率的影响

如图3所示，试验处理3 d后，S1组甜椒幼苗叶片MDA含量和相对电导率与CK组均无显著差异；处理7 d后，S1组MDA含量较CK组显著降低，而二者的相对电导率差异不显著。高温处理导致甜椒幼苗叶片的MDA含量和相对电导率显著升高，S2组相比CK组MDA含量和相对电导率分别上升了70.1%和37.0%。与S2组相比，S3组甜椒幼苗叶片的MDA含量和相对电导率分别降低了23.8%和28.2%。可见，高温导致甜椒幼苗叶片中有害物质MDA积累更多，从而使细胞膜渗透率增大，而喷施10 μmolL 6-BA可有效缓解这一状况。

3 讨论与结论

细胞分裂素是一类具有腺嘌呤环结构的植物激素，它在高等植物中通过对细胞分裂与分化的调节而广泛参与对植物生长发育的调控。6-BA作为一种外源类细胞分裂素也有类似的效果，但作用效果因处理浓度、作物类型、处理时植株发育状态会有所差异[18]。梦云等[19]研究发现，300 mgL 6-BA对‘天红2号’苹果苗腋芽萌发的作用效果最好。张海娜等[20]发现，10 mgL 6-BA增加了棉花的株高、单株出生叶数、单株叶面积和单株干重。本研究中，常温下喷施10 μmolL 6-BA增加了甜椒幼苗的生长量，说明该浓度未对植株产生胁迫作用，而且会轻度刺激植物生长。高温胁迫会阻碍植物生长并降低植物产量。本研究中，高温处理4 d后，甜椒幼苗各项生长指标均出现显著降低，喷施6-BA后植物生长逐步恢复到正常水平，说明6-BA对高温胁迫有一定缓解作用。

叶绿素是植物进行光合作用的物质基础，在光合作用中起着吸能和转能的作用。叶绿素的破坏与降解会直接导致光合作用效率的降低，其含量的高低在很大程度上反映了叶片光合作用的强弱[21]。赵莉等[22]研究发现，6-BA显著提高了香水百合叶片叶绿素的含量。本研究中常温下不同时间段外施6-BA除对叶绿素b含量有显著促进外，叶绿素a和叶绿素总含量也有上升，但均不显著，表明6-BA虽对植株光能吸收没有显著促进作用，但显然没有抑制作用。叶绿素的生物合成需要通过一系列的酶促反应，温度过高或过低都会抑制酶反应的进行，甚至会破坏原有的叶绿素[9]，所以温度对植物体内叶绿素含量有重要的影响。汪炳良等[23]研究发现，在35℃高温胁迫下，花椰菜叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量比对照下降25%以上，本研究得到了类似的结果，这可能是因为高温胁迫不仅降低了叶绿素的合成速率， 而且由于高温下活性氧大量积累，加速了叶绿素的降解。喷施外源6-BA以后，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量的下降得到了明显的缓解，这可能是由于高温条件下6-BA促进了叶绿素的合成，如6-BA 处理小麦叶片可促进叶绿素前体D-氨基乙酰丙酸的合成[24]。

叶绿素荧光参数的变化能在一定程度上说明植物对温度胁迫的耐受能力[25]。PSII实际光化学量子产量Yield反映了PSII反应中心在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率；PSII原初光能转换效率FvFm反映PSII反应中心光能转换效率；PSII实际光化学效率φPSII常用来反映电子在PSII与PSI的传递情况，与碳同化有密切联系[26]。NPQ表示非光化学淬灭，反映的是PSII天线色素吸收光能中不能用于光合电子传递而以热形式耗散掉的光能部分[27]，植物通过热耗散的形式减小外界环境对机体的伤害。本研究中，常温下喷施6-BA对叶绿素荧光参数Yield、FvFm、φPSII有不同程度的促进，其中Yield、φPSII显著升高，NPQ显著降低，说明常温下6-BA对甜椒叶片光能利用率有一定促进作用。Downes等[28]发现，6-BA通过调节核内编码叶绿体蛋白基因的表达，增加了光诱导的硝酸还原酶mRNA和捕光色素结合蛋白mRNA的含量，从这一点上可以推测6-BA在光能的吸收上起到了促进作用。另外有研究表明，6-BA 处理菠菜叶绿体能促进循环和非循环光合磷酸化反应，提高叶绿体的偶联程度及高能态的累积[29]，表明6-BA在光能传递利用率上的促进作用。本研究的结果和上述结果类似，高温胁迫导致Yield、FvFm、φPSII显著降低，说明高温胁迫对光能吸收、转换、传递都产生了抑制作用，NPQ的升高也进一步说明植物在光能传递上受阻，只能通过热耗散的形式避免植物进一步遭到伤害。高温胁迫下施加6-BA显著提高了Yield、FvFm、φPSII，降低了NPQ，说明6-BA可以增加PSII反应中心的开放比例，使光能捕获效率增大，增加氧化态QA(电子传递链中PSII受体侧原初醌受体)被还原的比例，说明被用于传递的光能增加了，进一步导致碳同化效率的增加。

在非逆境条件下植物体内自由基的产生和清除处于一种动态平衡，但在逆境条件下，平衡会被打破，自由基会大量增加，从而导致植物受到伤害[30]。本研究中，常温下喷施6-BA导致超氧阴离子降低，但不显著。这可能是由于6-BA引发了一个保护程序的响应，从常温下抗氧化酶SOD、POD、APX的升高可以得到这一验证。从对叶绿素荧光参数的分析中可以知道，高温胁迫抑制了电子传递，增强了分子态氧为受体的支路反应，从而导致了活性氧积累的增加，本研究发现高温胁迫后超氧阴离子显著升高。脂质过氧化是生命体的自然代谢过程，脂质中的多聚不饱和脂肪酸易受ROS攻击，形成脂质氢过氧化物和脂质降解的氧化产物(如MDA)，进而破坏细胞膜正常的结构和功能[31]。本研究中，高温胁迫后，MDA含量和相对电导率明显升高，从而佐证了高温胁迫后导致的超氧阴离子升高后一系列的后续反应。高温胁迫下喷施6-BA后，超氧阴离子、MDA含量和相对电导率都不同程度的显著降低，说明6-BA对超氧阴离子的清除有一定促进作用。植物清除活性氧主要依靠抗氧化酶类，包括超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶等[32]。有研究表明，高温胁迫下SOD活性会降低[33]，APX活性会升高[34]。本研究有类似的结果，高温胁迫后，SOD活性显著降低，POD、APX活性显著升高，表明高温胁迫刺激了抗氧化酶活性的升高，但温度过高导致了部分SOD降解，从而低于正常水平。高温胁迫下喷施6-BA明显提高了以上3种酶的活性，这有利于其及时清除活性氧自由基，减少膜脂过氧化产物MDA的生成，保护膜的结构和功能的完整。对于6-BA的这种促进作用，有报道称6-BA可促进低温逆境下SOD的从头合成[35]，表明6-BA参与了抗氧化酶的合成过程，可能是6-BA刺激了合成过程中一些关键酶的表达。

综上所述，高温胁迫显著抑制甜椒幼苗的生长，而10 μmolL 6-BA能有效缓解高温对甜椒幼苗产生的伤害，其可能的生理生化机制为：6-BA在高温胁迫下促进了叶绿素的合成，缓解了高温导致的叶绿素含量降低，从而维持正常的光合作用；6-BA在光能的吸收、能量转换、电子传递上起到了促进作用，使植物对光能的利用效率显著提升；6-BA增强了体内抗氧化酶活性以减轻膜脂过氧化作用，进而降低超氧阴离子的产生速率及有害物质MDA的积累。此外，低浓度6-BA(10 μmolL)在常温下对甜椒幼苗生长具有一定的刺激作用。