精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响

梅凤琦 甄锦壮 麦福劲 何正枝

【摘要】 目的：探討精液冷冻前优化处理方式对不同精子活力的精子冷冻复苏效果的影响。方法：选取符合条件的标本50份，每份标本等分4份，以原液作为对照（A组），分别采用三种不同方式[洗涤法（B组）、上游法（C组）和密度梯度离心法（D组）]进行处理，再行精子冷冻复苏。比较不同精子活力标本在不同优化方法处理后的精子冷冻复苏率。结果：精子冷冻复苏率由高至低排序为A组>C组>D组>B组。B组和D组精子冷冻复苏率均显著低于A组（P<0.05），C组与A组比较差异无统计学意义（P>0.05）。低活力（前向运动精子PR≤32%）标本中，各处理方式精子冷冻复苏率比较差异无统计学意义（P>0.05）。正常活力（前向运动精子PR>32%）标本中，B组精子冷冻复苏率显著低于其余三组（P<0.05），A组、C组、D组三组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏率有影响，实际工作中，应根据精液的质量选择合适的精液冷冻前优化处理方式。

【关键词】 精液冷冻 精液优化处理 精子冷冻复苏率

Effect of Spermatozoa Selection before Freezing on Recovery Rate of Human Frozen Spermatozoa/MEI Fengqi， ZHEN Jinzhuang， MAI Fujin， HE Zhengzhi. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： -116

[Abstract] Objective： To investigate the effect of spermatozoa selection before freezing on the recovery rate of human frozen spermatozoa of different sperm motility. Method： A total of 50 specimens that meet the requirements were selected. Each sample was divided into 4 equal parts， and the stock solution was used as a control （group A）. Before sperm freezing and recovery， the spermatozoa selection was carried out in three different ways [washing （group B）， swimming-up （group C） and density-gradient centrifugation（group D）]. The recovery rate of frozen spermatozoa of different sperm motility with different treatment was compared. Result： The sperm recovery rate was ranked from high to low in group A > group C > group D > group B. The sperm recovery rate of group B and group D were significantly lower than those of group A （P<0.05）， and there was no significant difference between group C and group A （P>0.05）. In low vitality （PR≤32%）， there was no significant difference in the sperm recovery rates between the treatments （P>0.05）. In normal vitality （PR>32%）， the sperm recovery rate in group B was significantly lower than those of the other three groups （P<0.05）， and there was no significant difference among group A， group C， and group D （P>0.05）. Conclusion： The spermatozoa selection before freezing has an effect on the recovery rate of frozen spermatozoa.In actual work， the appropriate semen pre-freezing treatment should be selected according to the quality of semen.

[Key words] Frozen spermatozoa Spermatozoa selection Recovery rate of frozen spermatozoa

First-authors address： Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University （Maternal & Child Health Hospital of Shunde Foshan）， Foshan 528300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.028

自精保存作为人类辅助生殖技术（ART）中一个重要组成部分，为男性患者进行ART前提供了精子解决方案[1]。常规精子冷冻保存技术是采用精液原液，但国内生殖中心的冷冻保存空间日渐紧张[2]，继续使用精液原液作为自精保存将占用更多的空间。精液经过优化处理后，可去除大部分非精子物质，收集活力与形态更好的精子[3]，同时减少了体积，可节省冷冻空间。本文主要探讨精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏的影响，特别是对不同活力精子的影响，旨为精液冷冻前选择合适的优化处理方式提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月-2019年7月在本院生殖中心就诊，进入ART技术治疗的男性患者精液标本。所有患者均进行以下检查：精液常规，乙肝、丙肝、获得性免疫缺陷综合征（HIV）病毒、梅毒螺旋体等感染项目检查。根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》5版标准进行精液分析[4]，将液化正常，精液量≥2.0 mL，精子浓度为（70～200）×106/mL，正常形态≥4%的标本共50份纳入研究。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 丹麦ORIGIO SAGE Quinns试剂，ART-1006为精子洗涤培养液，ART-2024为梯度离心培养液，ART-8022为精子冷冻保护试剂。

1.2.2 仪器 生物显微镜（奥林巴斯），普通离心机（北京白洋），Makler精子计数板（以色列），培养箱（美国Thermo）。

1.3 方法

1.3.1 精液标本收集 所有研究对象均禁欲2～7 d，在专用取精室内以手淫方式取精，并全部收集于无菌取精杯内，取出的精液标本放置于37 ℃水浴箱内液化。

1.3.2 精液常规分析 精液标本完全液化后，按WHO《人类精液检查与处理实验室手册》5版标准进行精液分析，包括精液量、精子浓度、精子活力、正常形态精子百分比等。各处理组冷冻前和复苏后按同样方法进行分析。其中前向运动精子（PR）≤32%为低活力，PR>32%为正常活力。

1.3.3 精子优化处理方法 每份精液标本充分混匀后，分别取0.5 mL，以原液作为对照，另外用三种不同方法（洗涤法、上游法、密度梯度离心法）进行冷冻前优化处理，共四组。

1.3.3.1 原液（A组） 标本不经处理直接进入冷冻步骤。

1.3.3.2 洗涤法（B组） 标本加入ART-1006混匀后，300 g离心6 min，离心后弃上清，用ART-1006重悬沉淀物，调至0.5 mL后计数备用。

1.3.3.3 上游法（C组） 在标本上方，缓慢加入1.2倍的ART-1006，倾斜45°并置于37 ℃培养箱内上游30 min。上游后吸取上层液，加入ART-1006混匀后，300 g离心6 min，离心后弃上清，用ART-1006重悬沉淀物，调至0.5 mL后计数备用。

1.3.3.4 密度梯度离心法（D组） 在无菌锥形离心管中，用ART-2024制备密度梯度液，下层为80%PureCeption，上层为40%PureCeption。使用

1︰1︰1的体积比，将标本加于梯度液上层。500 g离心15 min，离心后弃上清，保留沉淀物，加入ART-1006试剂后，300 g离心6 min，离心后弃上清，用ART-1006重悬沉淀物，调至0.5 mL后计数备用。

1.3.4 精子冷冻与复苏

1.3.4.1 精子冷冻 用ART-8022按1︰1体积比例添加到各组精子悬液中。将混合物置于4 ℃冰箱15 min，再悬挂于液氮上方10 cm处15 min，最后投入液氮中保存。

1.3.4.2 精子复苏 冷冻一周后，将精子混合物从液氮中取出，立即置于37 ℃水浴箱里10 min。充分混匀后进行精液分析。

1.3.5 精子冷冻复苏效果的评价标准 采用精子冷冻复苏率作为精子冷冻复苏效果的评价标准，公式如下：精子冷冻复苏率=（复苏后PR百分率）/（冷冻前PR百分率）×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间均数比较采用Friedman检验，两两比较采用Wilcoxon符号秩检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同冷冻前优化处理方法的复苏后PR百分率比较 50份标本低活力21份，正常活力29份。不同活力的标本，经C组处理，其冷冻复苏后的PR百分率显著高于A组、B组、D组（P<0.05），见表1。

2.2 不同冷冻前精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率比较

2.2.1 50份经各精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率比较 各精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率由高至低的排序为A组[（64.36±21.51）%]>C组[（61.93±15.09）%]>D组[（55.37±14.63）%]>B组[（50.93±17.74）%]。C组比A稍低，但差异无统计学意义（P>0.05）;C組与B组和D组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。B组与A组、C组和D组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。D组与A组、B组和C组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2.2 21份低活动力标本经各种精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率比较 各精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率由高至低的排序为C组[（63.54±15.74）%]>A组[（62.68±22.07）%]>B组[（54.03±18.73）%]>D组[（52.98±13.93）%]，各组精子冷冻复苏率比较，差异无统计学意义（P=0.119）。

2.2.3 29份正常活力标本经各种精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率比较 各精液优化方法处理后的精子冷冻复苏率由高至低的排序为A组[（65.58±21.40）%]>C组[（60.76±14.78）%]>D组[（57.10±15.12）%]>B组[（48.68±16.97）%]。B组显著低于A组与C组，差异有统计学意义（P<0.05）;B组与D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;A组、C组、D组三种优化处理方法精子冷冻复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

精子在冷冻复苏过程会有一定的损伤，其机制在于细胞内形成冰晶[5]、产生活性氧（ROS）等[6]，导致复苏后精子活力下降[7]。有研究提示，精子参数对ART技术结局有一定影响[8-10]。所以提高复苏后精子活力与冷冻复苏率成为关键。

本研究结果显示，洗涤组的精子冷冻复苏率较低。洗涤法采用离心方式去除精浆。离心作为ATR技术中精液处理的常规操作，但离心过程会增加ROS，史潇等[11]进一步证实离心时间对精子活力有影响。精浆内包含部分抗氧化物质[12]，去除精浆可能让精子抗ROS能力减弱，导致精子冷冻复苏率下降。除非精液标本精子浓度很低，则不建议采用洗涤法作为冷冻前优化处理的首选方法。

近年来，很多学者均尝试在精子冷冻前添加各种物质，如维生素E[13]、番茄红素[14]、异柠檬酸[15]等，用来提高复苏后精子活力。虽然这些方法能有效提高精子复苏后的活力，但目前尚无充分证据证明，冷冻前添加其他物质，对ART技术中后续的胚胎发育是否有影响[16]。所以在实际工作中，添加其他保护剂来提高复苏后精子活力的应用相对有限。本研究结果显示，上游法处理后的标本在复苏后精子活力最高，同时上游组的精子冷冻复苏率与原液组的相近，特别是低活力（PR≤32%）时，上游法的精子冷冻复苏率比原液组的稍高。这与Petyim等[17]研究结果相似。上游法在各精子优化处理方法中，对精液标本的干预较少，能筛选出活力较好的精子，并大幅降低死精子的比例。提示自精保存中，特别是低活力标本，采用上游法进行冷冻前优化处理，可提高复苏后的精子活力，并与精液原液冷冻复苏有相近的效果。但上游法也有不足，其所收集的精子总数相比其他方法的欠理想[18]。由于ART技术中，如宫腔内人工授精（IUI）和体外受精（IVF）技术，对精子总数有一定要求[19-20]，所以对于低活力且低浓度的标本不建议采用上游法进行冷冻前预处理，否则会造成复苏后的活动精子总数不足以进行IUI/IVF技术。

密度梯度离心法能收集形态正常和活力较好的精子。郑春毅等[21]认为，密度梯度离心法更适用于严重少、弱、畸形精子症或精子DNA碎片率较高的标本。本研究中，正常活力的标本使用上游法或密度梯度离心法，其精子冷冻复苏率与原液比较，差异无统计学意义。提示活力正常、低浓度标本可通过密度梯度离心法收集更多的活动精子，并与原液冷冻复苏有相近的效果。

综上，精子冷冻前的优化处理方式对精子冷冻复苏效果有一定影响。为取得与精液原液相近的精子冷冻复苏效果，同时减少占用冷冻保存空间，可选择上游法进行冷冻前的精液处理。对于低活力且低浓度的精液标本，则不建议采用上游法。对于活动力正常、低浓度精液标本，还可使用密度梯度离心法收集更多的活动精子。实际工作中，应根据精液质量来选择合适的方法进行冷冻前预处理。

参考文献

[1]马春杰，庄嘉明，邓顺美，等.广东人类精子库生殖保险及临床应用13年回顾性分析[J].广东医学，2017，38（5）：748-750.

[2]全松，黄国宁，孙海翔，等.冷冻胚胎保存时限的中国专家共识[J].生殖医学杂志，2018，27（10）：925-931.

[3]李明国，张斌，李亚玮，等.多次精液优化技术的临床应用进展[J].解放军医药杂志，2016，28（9）：114-116.

[4]谷翊群，陈振文，卢文红，等，译.WHO人类精液检查与处理实验室手册[M].5版.北京：人民卫生出版社，2011.

[5]魏哲文，杨竣，王涛，等.人类精子冷冻保存技術的研究进展[J].临床泌尿外科杂志，2017，32（12）：923-925.

[6] Amidi F，Pazhohan A，Shabani Nashtaei M，et al.The role of antioxidants in sperm freezing：a review[J].Cell and Tissue Banking，2016，17（4）：745-756.

[7] Kopeika J，Thornhill A，Khalaf Y.The effect of cryopreservation on the genome of gametes and embryos：principles of cryobiology and critical appraisal of the evidence[J].Human Reproduction Update，2014，21（2）：209-227.

[8]陈绍威，王明勇，付莉，等.精液处理前、后精子3项对IVT-ET结局的相关性分析[J].重庆医学，2017，46（32）：4526-4528，4532.

[9] Li B，Ma Y，Huang J，et al.Probing the Effect of Human Normal Sperm Morphology Rate on Cycle Outcomes and Assisted Reproductive Methods Selection[J].PLoS One，2014，9（11）：e113392.

[10]邱峰龙，左阳花，冯播，等.不同精液优化处理方式前后精子质量参数的变化及对IVF-ET结局的影响[J].中国临床研究，2017.30（1）：109-112.

[11]史潇，王婷，周瑶，等.体外操作对人精子運动参数及细胞内活性氧簇的影响[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2016，35（5）：369-371.

[12] Agarwal A D，Durairajanayagam D，Plessis S.Utility of antioxidants during assisted reproductive techniques：an evidence based review[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2014，12：112.

[13]韩鹏，王尚乾，唐敏，等.维生素E对人精子冻融氧化应激损伤的保护作用[J]. 中华男科学杂志，2014，20（2）：147-151.

[14]梁作文，郭凯敏，戴小凡，等.番茄红素对人精子冷冻损伤的保护作用及机制研究[J].中华男科学杂志，2015，21（6）：521-526.

[15]赵凯，陈伟，徐爱明，等.异柠檬酸在精子冻融中保护作用的初探[J].南京医科大学学报（自然科学版），2017，37（2）：165-168.

[16] Agarwal A，Majzoub A.Role of Antioxidants in Assisted Reproductive Techniques[J].The World Journal of Mens Health，2017，35（2）：77-93.

[17] Petyim S，Neungton C，Thanaboonyawat I，et al.Sperm preparation before freezing improves sperm motility and reduces apoptosis in post-freezing-thawing sperm compared with post-thawing sperm preparation[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics，2014，31（12）：1673-1680.

[18]谭玉梅，宋革，祝晓丽，等.密度梯度离心联合上游法的精液处理在供精体外受精胚胎移植中的应用[J].中国医学创新，2015，12（22）：56-58.

[19]刘文静，李文涛，张荣玲，等.宫腔内人工授精临床妊娠率的影响因素分析[J].中华男科学杂志，2015，21（11）：992-996.

[20]中华医学会生殖医学分会.人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识（2016）[J].生殖医学杂志，2017，26（1）：1-8.

[21]郑毅春，梁嘉颖，杜鹏，等.精液保存和优化处理方法对精子DNA完整性的影响[J].中华男科学杂志，2016，22（5）：432-436.

（收稿日期：2019-11-11） （本文编辑：程旭然）