卵泡液中的sRAGE水平对PCOS的影响

王亮 王碧君 闫广伟 丁燕子 崔晨航 付梦宇 袁恩武

【摘要】 目的：分析卵泡液中的可溶性晚期糖化終产物受体（sRAGE）水平对多囊卵巢综合征（PCOS）的影响。方法：选取2017年10月-2018年12月在本院接受IVF-ET助孕的患者，其中仅因输卵管梗阻因素行IVF-ET患者49例为对照组，仅因PCOS因素行IVF-ET患者53例为试验组。患者均采用相同促排卵方案，比较两组一般资料、性激素水平（LH/FSH、T、E2）、代谢参数（Gn总量、Gn天数、取卵数）以及卵泡液中sRAGE、血管内皮生长因子（VEGF）和C反应蛋白（CRP）浓度;分析试验组卵泡液sRAGE水平与相关临床参数的相关性;分析试验组卵泡液sRAGE与VEGF、CRP水平的相关性。结果：两组年龄、BMI、E2、Gn天数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;试验组LH/FSH、T、Gn总量、取卵数均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。试验组卵泡液sRAGE浓度低于对照组，VEGF和CRP因子浓度均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。试验组卵泡液sRAGE水平与Gn总量、VEGF、CRP水平均呈负相关（P<0.05），与年龄、BMI、Gn天数、取卵数均无相关性（P>0.05）。结论：PCOS患者卵泡液sRAGE浓度降低，并与VEGF和CRP蛋白水平均呈负相关。

【关键词】 可溶性晚期糖化终产物受体 多囊卵巢综合征 炎症 体外受精-胚胎移植

[Abstract] Objective： To analyze the effect of soluble receptor for advanced glycation endproducts （sRAGE） level in follicular fluid on polycystic ovary syndrome （PCOS）. Method： Patients who received in vitro fertilization and embryo transfer （IVF-ET） in our hospital from October 2017 to December 2018 were selected， among them， 49 patients with IVF-ET only due to fallopian tube obstruction were in the control group， 53 patients with IVF-ET only due to PCOS were in the experimental group. All the patients were treated with the same ovulation promotion program. The general data， sex hormone levels （LH/FSH， T， E2）， metabolic parameters （total amount of Gn， Gn days， number of oocytes taken） and the concentrations of sRAGE， VEGF and CRP in follicular fluid were compared between the two groups; the correlation between sRAGE level of follicular fluid and related clinical parameters in experimental group were analyzed; the correlation between sRAGE， VEGF and CRP levels of follicular fluid in experimental group were analyzed. Result： There were no significant differences in age， BMI， E2 and Gn days between the two groups （P>0.05）. The LH/FSH， T， total amount of Gn and oocytes extracted number in the experimental group were higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The concentration of sRAGE in follicular fluid of the experimental group was lower than that of the control group， and the concentration of VEGF and CRP factors were higher than those of the control group （P<0.05）. The sRAGE level of follicular fluid in the experimental group were negatively correlated with the total amount of Gn， VEGF and CRP levels （P<0.05）， but not with age， BMI， Gn days and oocytes extracted number （P>0.05）. Conclusion： SRAGE concentration in follicular fluid decreased in PCOS patients， and were negatively correlated with VEGF and CRP protein levels.

多囊卵巢综合征（PCOS）是目前已知的引发女性不孕因素的最常见疾病之一，是一种以高雄激素血症、卵巢多囊样改变和稀发排卵为主要表现的代谢紊乱综合征[1]。PCOS病因至今尚未阐明，可能是由某些遗传基因与环境因素相互作用引起，其发生发展的中心环节除了胰岛素抵抗及高雄激素血症，目前研究认为炎症反应也是导致PCOS发生的重要环节[2]。

糖基化终末产物受体（RAGE）是免疫球蛋白超家族的成员，其水平增加与细胞外调节蛋白激酶激活和核因子信号通路激活有关，进而产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、C-反应蛋白（CPR），导致细胞功能障碍和介导多种疾病发生[3-4]。晚期糖基化终末产物的可溶性受体（sRAGE）是一种特殊的缺失受体膜镶嵌区域和胞内段的RAGE亚型。在循环血液及组织中，sRAGE与RAGE竞争结合配体，从而抑制RAGE诱导的多种细胞信号传导途径，因此被称为“诱饵受体”，作为保护因子阻止、延缓糖尿病、动脉粥样硬化等，并可作为一种标记物反映体内的病理发展水平。

RAGE系统在介导卵巢微环境改变和激发PCOS炎症反应的作用已经达成共识[5]，但sRAGE和炎性因子的关系尚未明确。Romero等[6]认为早产患者羊水中sRAGE表达增加与其炎症程度呈正相关，Rzepka等[7]观察到血浆中sRAGE和CRP成负相关，进而得出血清中高浓度sRAGE可避免早产的结论。在生殖内分泌领域，Merhi等[8]首先报道sRAGE与卵巢储备功能呈正相关，本课题组也发现卵泡液中高sRAGE水平可预测较好的体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局[9]。但sRAGE与PCOS的关联及其在PCOS疾病中的具体作用及机制尚不清楚。本研究比较了PCOS女性和非PCOS女性卵泡液中sRAGE的浓度差异，并分析了PCOS患者卵泡液sRAGE浓度与炎症因子浓度的相关性，研究“诱饵受体”sRAGE在PCOS的作用，希望从PCOS的病因着手，寻找PCOS的治疗靶点。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月-2018年12月在郑州大学第三附属医院生殖中心接受IVF-ET助孕的患者，其中仅因输卵管梗阻因素行IVF-ET者49例为对照组，仅因PCOS因素行IVF-ET者53例（PCOS诊断根据鹿特丹标准[10]）为试验组。纳入标准：年龄≤35岁，18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2[11]。排除标准：患有糖尿病、慢性肾脏疾病、慢性代谢性疾病及子宫内膜异位症的妇女。该研究得到郑州大学第三附属医院伦理委员会的批准，所有参与者均签署了书面知情同意书。

1.2 标本收集及测定

1.2.1 血清收集及内分泌测定 月经周期第2～4天晨起抽取空腹肘部静脉血约5 mL于抗凝管中，测定性激素十项，记录结果。

1.2.2 卵泡液的收集 患者均采用相同的长长促排卵方案[12]，其中试验组需提前口服去氧孕烯炔雌醇片（商品名：妈富隆，生产厂家：N.V.Organon，注册证号：H20171176，规格：每片含去氧孕烯0.15 mg和炔雌醇30 μg），月经第1天起给药，1片/d，连续服21 d，随后停药7 d，为一周期。在停药的第8天再次开始一下周期，共计3个周期。两组降调[月经第2～3天予长效GnRH-a皮下注射，即注射用醋酸曲普瑞林（商品名：达菲林，生产厂家：Ipsen Pharma，注册证号：H20140298，规格：3.75 mg）]达标后肌内注射促性腺激素（Gn）：注射用重组人促卵泡激素[商品名：果纳芬，生产厂家：Merck Serono SA Aubonne Branch，注册证号：S20130055，规格：5.5 μg（75 IU）]，150～225 IU/次，1次/d。当至少有2个主导卵泡直径接近18 mm时，肌内注射hCG[重组人绒促性素注射液（商品名：艾泽，生产厂家：Merck Serono S.p.A.，注册证号：S20130091，规格：250 μg︰0.5 mL）] 250 μg，34～36 h后行取卵术。取第1管无血染卵泡液1 mL离心，-80 ℃储存。

1.2.3 sRAGE、血管内皮生长因子（VEGF）及CRP测定 采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），试剂盒由R&D公司生产，严格按照试剂盒说明书操作。操作步骤：待测样品以2 000 bpm离心15 min，取上清液待测。设置标准品孔、待测样品孔，标准品孔加入100 μL标准品（按浓度剃度加入），样品孔加入100 μL待测样品，充分混匀后于37 ℃反应120 min。实验缓冲液侵洗后，每孔中加入200 μL检测抗体，封板膜密封，室温孵育120 min。重复洗板4次，每孔中加入200 μL底物溶液，封好孔板，室温孵育30 min。依序每孔中加入终止溶液50 μL，终止反应，混合30 s，反应终止后立即检测，用酶联仪在450 nm波长依次测量标准品和待测样品孔内光密度（OD值）并绘制标准曲线。

1.3 观察指标 比较两组一般资料（年龄、BMI）、性激素水平[促黄体生成素（LH）/促卵泡生成激素（FSH）、睾酮（T）、雌二醇（E2）]、代谢参数[Gn总量（校正药物剂量均为IU）、Gn天数、取卵数]以及卵泡液中sRAGE、VEGF和CRP浓度;分析试验组卵泡液sRAGE水平与相关临床参数的相关性;分析试验组卵泡液sRAGE与VEGF、CRP水平的相关性。

1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;相关性采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料、性激素水平和代谢参数比较两组年龄、BMI、E2、Gn天数比较，差异均无统计學意义（P>0.05）;试验组LH/FSH、T、Gn总量、取卵数均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 兩组卵泡液sRAGE、VEGF和CRP浓度比较 试验组卵泡液sRAGE浓度（654.208±216.719）pg/mL，低于对照组的（1 631.081±845.306）pg/mL，差异有统计学意义（t=8.132，P=0.000）;试验组卵泡液VEGF和CRP因子浓度分别为（157.173±24.373）、（9.359±1.605）pg/mL，均高于对照组的（108.869±12.682）、（5.620±1.363）pg/mL，差异均有统计学意义（t=12.404、12.630，P=0.000、0.000）。

2.3 试验组卵泡液sRAGE水平与相关临床参数的相关性分析 试验组卵泡液sRAGE水平与Gn总量呈负相关（r=-0.304，P=0.027），与年龄、BMI、Gn天数、取卵数均无相关性（r=0.077、0.125、0.032、-0.143，P=0.583、0.372、0.821、0.307）。

2.4 试验组卵泡液sRAGE与VEGF、CRP水平的相关性分析 在校正年龄和Gn剂量后，试验组卵泡液sRAGE与VEGF、CRP水平均呈负相关（r=-0.319、-0.328，P=0.020、0.016），见图1。

3 讨论

过去的20年里，不断有证据支持RAGE对氧化应激和炎症的介导作用，这些过程改变卵巢微环境，可能会导致不孕[13]。但sRAGE在生殖领域的研究直到2014年才出现。Merhi等[8]发现卵泡液高sRAGE水平与卵巢储备功能标志物呈正相关，从而认为sRAGE可能在卵泡发育环境中起积极作用[14]。然而，有些学者得出了相反的结论：卵泡内sRAGE水平与胚胎发育呈负相关[15]。但本课题组相关研究显示，卵泡液中sRAGE蛋白水平与本周期促性激素使用量成反比，和取卵数成正比，回归分析结果表明卵泡液sRAGE较高的妇女IVF-ET助孕结局较好[9]。研究结果支持卵泡液中sRAGE在卵巢微环境中起保护作用的学说。在本研究中，试验组卵泡液sRAGE浓度低于对照组（P<0.05），但卵泡液中低sRAGE水平是否与PCOS发生相关，目前尚不清楚。而且本研究结果显示，试验组卵泡液sRAGE水平与年龄、BMI、Gn天数、取卵数均无相关性（P>0.05），与Gn总量呈负相关（P<0.05），这表明sRAGE可能有利于生育内环境，即生殖潜力。

关于sRAGE与VEGF的关联目前也存在争议。Goova等[16]发现高浓度sRAGE可以增强表皮细胞中VEGF的表达进而加速皮肤伤口愈合，这可能与特定细胞特定部位的作用有关。但PCOS卵泡液中sRAGE浓度与VEGF间的关联尚不清楚。在本研究中，试验组卵泡液sRAGE与VEGF水平呈负相关（P<0.05）。目前，越来越多的证据表明VEGF在PCOS的发病机制中血管发生的变化起主要作用[17]，且卵泡液VEGF浓度升高会降低辅助生殖技术的妊娠率[18]。因此，卵泡液中sRAGE与VEGF负相关是支持其保护作用的证据，至于sRAGE是否直接抑制VEGF是生成则需要进一步做干预实验。

炎症通过影响下丘脑引起疾病-垂体-性腺轴导致卵泡闭锁。最近的研究表明，慢性炎症与PCOS发病机制和长期风险有关。CPR是炎症重要的标志之一，是由肝细胞在促炎性细胞因子（如IL-6和TNF-α）的刺激控制下产生的急性期反应物。为了探讨PCOS患者卵泡液中sRAGE浓度与炎症因子的关系，本课题组用ELISA法进行了测量，发现试验组卵泡液CRP因子浓度高于对照组（P<0.05），与文献[19]结果一致;而且试验组卵泡液sRAGE与CRP水平呈负相关（P<0.05）。因此，笔者推测sRAGE可能作为一个保护因子从炎症视角预防PCOS的发生。

综上所述，PCOS患者卵泡液sRAGE浓度降低，并与VEGF和CRP蛋白水平均呈负相关，故推测卵泡液中sRAGE可能通过抑制炎症反应进而在PCOS中起保护作用。接下来笔者将进行sRAGE干预实验，研究颗粒细胞、组织和整个动物炎症反应，验证sRAGE是否对PCOS具有保护作用，进而为其临床治疗提供新思路。

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（收稿日期：2019-12-12） （本文編辑：董悦）