血清反复冻融对25-羟基维生素D水平的影响*

张晨曦，石莲花，金有训，马瑞敏，刘书筠，刘佳佳，张文丽，吕 虹,3，张国军,3，康熙雄,3△

(1.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，北京 100071；2.中国计量科学研究院，北京 100029；3.北京市免疫试剂临床工程技术研究中心，北京 100050)

维生素D作为人体必需的营养素之一，对人体健康有非常重要的作用。越来越多的研究发现，维生素D不但具有调节钙磷代谢等效应，还与心血管疾病、肿瘤、糖尿病、高血压、免疫性疾病等多种疾病密切相关。因此监测体内的维生素D水平对预防疾病及疾病的诊断治疗尤为重要[1-2]。目前，25-羟基维生素D检测方法按照检测原理可分成免疫法和色谱法两大类。可根据检测目的、 检测对象、 实验室人员技术能力和实验设备等因素综合考虑，选择合适的检测方法[3]。但检测结果的准确性，受检测前、检测中等多因素的影响。检测前的影响之一就是标本的储存条件，由于标本储存不当造成检验结果不准确的现象时有发生，受很多条件的限制影响，许多标本不能当天检测，需要对标本进行保存[4]。保存条件可分为低温保存及冻融保存等，血清中的各种成分对反复冻融的次数可能有不同的耐受性，会出现相应指标的升高降低或是不变[5-7]。严格控制实验条件，探索反复冻融对血清中25-羟基维生素D水平的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 由符合正态分布的静脉血混制而成，制备成血清标准物质，无溶血、乳糜、黄疸等。

1.2 仪器与试剂 高速低温离心机(Thermo Scientific 公司,美国)；涡旋振荡器(Thermo Scientific 公司,美国)；-80 ℃ 低温冰箱(Thermo Scientific 公司,美国)；-20 ℃低温冰箱(Sanyo 公司,日本)；Cobas e 602全自动电化学发光免疫分析仪(Roche 公司,瑞士)；巴瑞医疗器械有限公司提供的25-羟基维生素D检测试剂盒(电化学发光法)。

1.3 方法 取制备好的血清标准物质12份，随机分配为3组，每组4份并编号处理，分别检测25-羟基维生素D水平作为初始水平。然后分别密封保存于相应温度下的冰箱中，每隔2 h取出，恢复至室温，震荡混匀后，再分别测试其水平并记录。每次测试前，都保证仪器在质控范围内，除外仪器误差。

2 结 果

血清冻融前后，25-羟基维生素D均值水平变化见表1、图1。在3个温度条件下探索反复冻融对25-羟基维生素D水平的影响，第4次及以上反复冻融时，与初始水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。4 ℃条件下，第5次冻融时与初始水平相比，差异无统计学意义(P>0.05)，但仍呈升高趋势；而在-80 ℃条件下，第1次冻融时25-羟基维生素D水平与初始水平相比，差异有统计学意义(P<0.05)，可见-80 ℃保存样本，受冻融循环影响更大。图2分别描述了不同温度条件下，每个样本随冻融次数的变化趋势。每个标本在每次冻融时，25-羟基维生素D水平变化不稳定，但与初始水平比较，均是升高趋势，可见25-羟基维生素D水平随冻融次数增加，呈现升高趋势，且与冻融次数相关，反复冻融会明显影响25-羟基维生素D水平检测。

图1 不同温度下反复冻融25-羟基维生素D均值水平变化趋势

表1 不同温度下反复冻融时25-羟基维生素D的均值水平比较

注： 与初始水平比较，*P<0.05。

注：A表示4 ℃下25-羟基维生素D水平;B表示-20 ℃下25-羟基维生素D水平；C表示-80 ℃下25-羟基维生素D水平。
图2 不同温度下25-羟基维生素D水平随冻融次数变化趋势

3 讨 论

探讨反复冻融对生物指标水平影响的相关文献中，范泽涵等[8]研究冻存温度、次数及时间对血清生化指标稳定性的影响，发现相关生化指标在各种贮存条件下均不稳定。并且发现导致检测结果波动的因素有冻存温度、反复冻融次数、冻存时间,以及冻存温度、冻融次数与冻存时间分别产生的交互效应。GAO等[9]研究了反复冻融对相关肿瘤标志物的影响，发现某些指标不受短时间冻存的影响，而某些肿瘤标志物在第1次冻融时就出现显著变化。MAELEGHEER等[10]研究结论为反复冻融不影响抗磷脂抗体滴度。众所周知，血清中生物活性分子(包括蛋白质、代谢物、离子等)的变化可反映人体动态健康状态，某些分子可作为疾病诊断或预后的生物标志物，因此准确检测生物标志物水平至关重要。此次研究的25-羟基维生素D的作用之一是抗佝偻病，维持婴幼儿的正常生长发育,因此检测血循环中25-羟基维生素D水平是良好的评价维生素D营养水平的理想指标,也是维生素D缺乏和早期诊断佝偻病的重要依据[11-12]。此外亦有研究报道，血清中25-羟基维生素D水平与子痫前期的发生之间具有一定的相关性[13]。考虑25-羟基维生素D与多种疾病的相关性，使得准确检测25-羟基维生素D水平至关重要。在本次实验中，分别研究了在4 ℃、-20 ℃、-80 ℃条件下，每隔2 h将标本从冰箱中取出，恢复至室温，然后分别检测相应水平变化，结果显示25-羟基维生素D水平呈现升高趋势，且随冻融次数增加，检测结果与初始水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，综合分析其原因，尽管采取标本封盖、封口膜封口，防止血清标本蒸发等措施，因冻存时间的延长，最终还是影响检测结果，此结果与相关研究报道一致，随着保存时间的延长致使血清中水分蒸发加大，血清浓缩，其成分水平相对增加，检验结果也升高[14-16]。本研究探索了3个温度下的冻融影响，根据相关结果可以得出，维生素D在保存过程中的不稳定性，-80 ℃对其影响作用相对更为明显。

结合相关文献及此次实验结果，在对临床样本进行分析时，应尽快检测，避免标本反复冻融及多次重复检测，以免影响实验结果，对临床判断造成误差。此次实验只是探索了多次冻融的影响作用，未涉及到长时间冻存是否也影响相关指标的变化，因此后期实验中，可以进一步研究冻存时间对血清中25-羟基维生素D水平的影响。进一步指导临床样本检测。