KCNQ1和RFX3基因表达量作为原发性痛风诊断指标的探讨*

陈国强，赵 清，张雪芳，庾凤娟，巫剑雄，何凤珍，曾媛芷，陈智湘，许静燕，赵可伟，苏 镜△

(1.广州市海珠区江海街社区卫生服务中心，广东广州 510220；2.广州中医药大学第三附属医院检验科，广东广州 510145；3.广州市海珠区中医医院检验科，广东广州510220；4.广州中医药大学，广东广州511400)

原发性痛风是由于长期嘌呤代谢障碍(尿酸合成增多和或尿酸排泄减少)引起血尿酸增高从而导致组织损伤的一组疾病。流行病学调查显示，我国沿海地区无症状高尿酸血症和原发性痛风的发病率逐年上升，此外，无症状高尿酸血症及原发性痛风发病还与肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常、心脑血管等疾病密切相关[1]，严重危害了人类健康，成为亟待解决的公共健康问题。

原发性痛风是一种多基因遗传病，遗传因素是原发性痛风发病的主要因素。近年来，多个全基因组关联分析(GWAS)研究，确认了近50 多个影响尿酸水平和原发性痛风发生的易感基因位点，解释10%的尿酸水平变化。在中国汉族人群的首个大样本 GWAS 研究中，发现KCNQ1和RFX3 为中国人群特有的原发性痛风易感基因[2]，但是不同国家、地区和种族，基因表达差异不尽相同，而且KCNQ1和RFX3引发原发性痛风的确切机制目前尚不完全明确。目前在临床上常检测尿酸生成功能基因MTHFR，尿酸排泄功能基因ABCG2，尿酸重吸收功能基因SLC2A9来了解患者的遗传情况，KCNQ1和RFX3基因在临床上使用价值需要进一步的观察验证。因此，本文以广州市海珠区江海街社区卫生服务中心和广州中医药大学第三附属医院的原发性痛风和无症状高尿酸血症患者为研究对象，探索KCNQ1和RFX3基因水平的表达，旨在进一步揭示KCNQ1和RFX3基因与原发性痛风之间的联系，并对其临床应用价值进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年1-12月广州市海珠区江海街社区卫生服务中心和广州中医药大学第三附属医院的门诊及住院的无症状高尿酸血症和原发性痛风患者中符合要求的病例共136例。依据疾病进展情况分为原发性痛风组86例，其中急性期31例、间歇期44例、慢性期11例和无症状高尿酸血症组50例,另选同期来这两家医疗机构体检且无原发性痛风症状，也无高尿酸血症的患者81例作为对照组。

1.2 纳入标准 无症状高尿酸血症组入选标准依据2013年中华医学会内分泌学分会《高尿酸血症和痛风治疗的专家共识》标准[3]，收集男性空腹血尿酸水平大于420 μmol/L(7.0 mg/mL)，女性空腹血尿酸水平大于360 μmol/L(6.0 mg/mL)且不符合原发性痛风诊断标准的患者。原发性痛风组入选标准依据2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟痛风分类标准[4]，按照患者受累关节类型、发作特征、发作进程、痛风石的临证、血尿酸和相关影像学检查等指标进行评分，总分大于或等于8分即可诊断原发性痛风的患者。

1.3 排除标准 无症状高尿酸血症组排除存在其他引起血尿酸升高疾病和近期服用可引起血尿酸值升高的药物的患者，以及明确诊断痛风、恶性肿瘤、严重肾功能不全期、严重全身系统性疾病的患者[5]。原发性痛风组排除假性痛风症状的患者，包括急性化脓性关节炎、类风湿性关节炎、双水焦磷酸钙沉积症、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、骨关节炎、骨肿瘤等疾病。对照组排除痛风、高尿酸血症、高血压、冠心病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤等疾病患者。

1.4 仪器与试剂 贝克曼AU5800全自动生化仪，上海复星长征生化试剂盒，GE Healthcare公司提供单个核细胞提取试剂，QIAGEN GmbH 公司提供RNA提取试剂盒(离心柱型)，SimpliNano超微量紫外/可见分光光度仪，Hema9600基因扩增仪，宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)提供的逆转录cDNA试剂盒，Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪，江苏康为世纪生物科技有限公司提供的PCR试剂盒。

1.5 方法

1.5.1 标本收集 所有入选的研究对象均为禁食、禁水，于次日清晨空腹采集外周静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管1支，干燥管1支，血清用于生化检测3组人群的尿酸，全血用于分离单个核细胞(PBMC)。

1.5.2 单个核细胞提取 采用Ficoll密度梯度离心法，按照说明书步骤提取分离人外周血单个核细胞，加入Trizol 试剂置于-80 ℃保存备用。

1.5.3 总RNA提取、浓度和纯度检测 按照RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书进行RNA提取。超微量紫外/可见分光光度仪测定总RNA 的浓度和纯度，吸光度值(A)检测,A260/A280可以作为RNA 纯度的评定标准，研究标本RNA纯度保持在1.8～2.0，RNA浓度保持在80 ng/μL以上，RNA质量(ng)=浓度(ng/μL)×体积(μL)。

1.5.4 逆转录cDNA、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测RFX3和KCNQ1 mRNA 按照试剂盒进行RNA逆转录成cDNA，cDNA加入60 μL dH2O稀释备用。反应体系如下:2 μL RNA，RNA质量确保在5～10 ng，加ddH2O补足10 μL。反应条件为37 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃，30 min。

qPCR检测PBMC中RFX3和KCNQ1 mRNA表达水平。每个样本重复进行qPCR检测3次，取平均值作为该样本RFX3和KCNQ1基因的相对表达量。数据处理用ΔΔ循环阈值(Ct)法，ΔΔCt=ΔCt检测-ΔCt标准，平均相对含量=2-ΔΔCt作为统计数据，qPCR反应体系为qPCR引物中各引物的浓度为1 μmol/L，配液：ultra SYBR mixture 10 μL，正向和反向引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL；反应体系20 μL，2 μL cDNA，配液18 μL。qPCR反应条件按照95 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s循环，40个循环。引物设计序列见表1。

表1 引物设计序列

2 结 果

2.1 各组临床资料比较 原发性痛风组、无症状高尿酸血症组和对照组的平均年龄分别为(53.04±17.67)岁、(58.73±20.26)岁、(42.95±18.23)岁；原发性痛风组、无症状高尿酸血症组和对照组的男女比例分别为1.1∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.0，3组间年龄、男女比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 KCNQ1与原发性痛风、无症状高尿酸血症相关性研究 无症状高尿酸血症组KCNQ1 mRNA表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P=0.035 8)；原发性痛风组KCNQ1 mRNA表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.000 1)；原发性痛风组急性期KCNQ1 mRNA 表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P=0.000 1)；原发性痛风组与无症状高尿酸血症组KCNQ1 mRNA表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；原发性痛风组急性期KCNQ1 mRNA 表达量显著低于无症状高尿酸血症组，差异有统计学意义(P=0.029 7)。对照组、无症状高尿酸血症组、原发性痛风组、原发性痛风组急性期KCNQ1 mRNA表达量呈逐步降低趋势，差异有统计学意义(P<0.05),见图1、2。

注：与对照组比较，*P<0.05；与无症状高尿酸血症组比较，#P<0.05。
图1 各组KCNQ1 mRNA表达量变化趋势

2.3 RFX3与原发性痛风、无症状高尿酸血症相关性研究 对照组与无症状高尿酸血症组RFX3 mRNA 表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；原发性痛风组RFX3 mRNA 表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.000 1)；原发性痛风组急性期RFX3 mRNA 表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P=0.001 3)；原发性痛风组与无症状高尿酸血症组RFX3 mRNA 表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；原发性痛风组急性期与无症状高尿酸血症组RFX3 mRNA 表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组、原发性痛风组、原发性痛风组急性期RFX3 mRNA 表达量呈逐步下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、4。

注：A为对照组与无症状高尿酸血症组KCNQ1基因表达量的比较；B为对照组与原发性痛风组KCNQ1基因表达量的比较；C为对照组与原发性痛风组急性期KCNQ1基因表达量的比较；D为无症状高尿酸血症组与原发性痛风组KCNQ1基因表达量的比较；E为无症状高尿酸血症组与原发性痛风组急性期KCNQ1基因表达量的比较。
图2 3组间KCNQ1 mRNA表达量比较

注：A为对照组与无症状高尿酸血症组RFX3基因表达量的比较；B为对照组与原发性痛风组RFX3基因表达量的比较；C为对照组与原发性痛风组急性期RFX3基因表达量的比较；D为无症状高尿酸血症组与原发性痛风组RFX3基因表达量的比较；E为无症状高尿酸血症组与原发性痛风组急性期RFX3基因表达量的比较。
图3 各组间RFX3 mRNA 表达量比较

2.4 KCNQ1和RFX3 ROC曲线和诊断性能 根据约登指数=特异度+灵敏度-1，根据KCNQ1基因的 ROC曲线界值，得出诊断性能ROC曲线下面积(AUC)=0.639 5，灵敏度为56.63%，特异度为65.43%，KCNQ1基因在原发性痛风患病的阳性率为56.63%。根据RFX3基因的 ROC曲线界值得出诊断性能AUC=0.685 9，灵敏度69.88%，特异度60.49%，RFX3基因在原发性痛风患病的阳性率为69.88%，见表2、图5。

表2 KCNQ1和RFX3基因对原发性痛风诊断性能

注：与对照组比较，*P<0.05。
图4 各组RFX3 mRNA表达量变化趋势

注：A为KCNQ1基因ROC曲线；B为RX3基因ROC曲线。
图5 KCNQ1和RFX3基因ROC曲线

3 讨 论

原发性痛风是由高尿酸血症引发的一种常见疾病，受遗传因素和环境因素共同作用。近年来，原发性痛风患病率逐年增加，已成为一种常见且多发的全球性疾病[6-7]。流行病学调查显示，原发性痛风在发达国家的患病率已达2.49%[8]。在我国沿海地区无症状高尿酸血症和原发性痛风的发病率逐年上升，原发性痛风的患病率为1.36%,无症状高尿酸血症的患病率为16.99%[9]，但仅有10%～20%的无症状高尿酸血症患者会出现原发性痛风等症状[10]。因此，本文通过探索KCNQ1和RFX3基因水平的表达，为原发性痛风的发病机制奠基临床研究基础。在原发性痛风的临床特点和流行病学研究中，显示男性发生痛风的比例高达97.6%，女性仅为2.4%[11]。本研究结果显示，原发性痛风组、无症状高尿酸血症组和对照组年龄及男女比例比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明3组对象不受年龄及性别因素的影响。众所周知，进食富含三酰甘油和胆固醇食物，嘌呤合成亢进，使尿酸生成增加。脂肪代谢产物能够抑制尿酸排泄，导致尿酸排泄减少，血尿酸增高。本研究发现尿酸结果符合了无症状高尿酸血症及原发性痛风与肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常、心脑血管疾病密切相关的观点[12]。

原发性痛风是一种多基因遗传病，遗传因素是原发性痛风发病的主要因素[13]，目前亚洲人种中，已发现与原发性痛风或无症状高尿酸血症有关的易感基因16个，亚洲特有易感基因7个，中国特有易感基因2个。以往研究表明SLC2A9、SLC22A11和SLC22A12基因功能缺失性突变可引起遗传性低尿酸血症，而过表达则会加强尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1和SLC17A3基因功能缺陷型变异会降低肾脏和肠道对尿酸的排泄量。诱发尿酸排泄障碍(高重吸收和低排泄)的基因变异是影响无症状高尿酸血症和原发性痛风的主要遗传因素。另外，单基因稀有突变也会导致尿酸生成量的增加，PRPS1超活性和HPRT功能缺陷是影响尿酸合成量增加的重要遗传因素[14]。中国学者通过 GWAS 研究发现了新的与原发性痛风相关的易感基因RFX3和KCNQ1只在中国人群中发现[15]。但是不同国家、地区和种族，基因KCNQ1和RFX3表达差异不尽相同。日本GWAS研究发现，KCNQ1与原发性痛风有较强的相关性，而RFX3则无明显相关性[16]。其他研究发现中国汉族人群KCNQ1基因在原发性痛风患者中低表达，RFX3与原发性痛风有关联性[17]。YAMAGATA等[18]研究发现，KCNQ1与原发性痛风、糖尿病有密切关联，可引起血糖升高。由于不同国家、地区和种族，基因KCNQ1和RFX3表达存在差异，而且其在引发原发性痛风的确切机制目前尚不完全明确，在临床上使用价值需要进一步的观察验证。周慧等[19]研究报道证实了原发性痛风的发病与单核巨噬细胞有密切相关。本文通过研究原发性痛风患者外周血单个核细胞中KCNQ1和RFX3基因水平表达的分析，结果发现原发性痛风患者KCNQ1和RFX3 mRNA表达水平显著低于无症状高尿酸血症患者和对照组。结合本文研究结果，推测原发性痛风发病可能是通过尿酸盐晶体激活单核巨噬细胞分泌使KCNQ1和RFX3基因下调引起的。众所周知，尿酸盐结晶沉积于胰岛细胞，胰岛β细胞受损引起胰岛素分泌减少，尿酸盐沉积于外周组织及肌肉组织，导致靶细胞对胰岛素的敏感性降低，产生胰岛素抵抗，以上两个原因都可引起血糖升高。KCNQ1 在多个群体中鉴定为糖尿病和原发性痛风的易感基因，其能够影响胰岛β细胞对胰岛素的分泌或应答；而RFX3 是胰岛β细胞分泌的，RFX3蛋白可以结合到葡萄糖激酶基因的启动子区域，并调控其表达，从而影响胰岛β细胞的功能。前期研究发现血糖在无症状高尿酸血症患者和原发性痛风患者体内呈升高趋势，而本研究发现KCNQ1和RFX3基因在原发性痛风患者中表达下调。因此，发病机制可能是尿酸盐结晶沉积于胰岛β细胞，影响胰岛β细胞的功能，使KCNQ1和RFX3基因表达下调，进一步出现血糖和血脂代谢混乱，导致原发性痛风患者血糖、尿酸升高，形成恶性循环。

值得注意的是，有研究报道原发性痛风易感基因KCNQ1和RFX3与以往发现的相关基因不同。临床上常检测尿酸生成功能基因MTHFR，尿酸排泄功能基因ABCG2，尿酸重吸收功能基因SLC2A9来了解原发性痛风患者的遗传情况，而KCNQ1和RFX3基因是与无症状高尿酸血症进展为原发性痛风有关[20]。本研究把原发性痛风组患者分为急性期、间歇期和慢性期，原发性痛风组急性期KCNQ1和RFX3 mRNA表达量显著低于原发性痛风组，而且对照组、无症状高尿酸血症组、原发性痛风组、原发性痛风组急性期患者依次呈明显下降趋势。与2015年LI等[15]研究团队在中国人群中成功鉴定出的KCNQ1和RFX3与高尿酸血症进展为原发性痛风有关的结论一致，KCNQ1和RFX3基因在原发性痛风发作时下调更加明显。通过ROC曲线分析，发现KCNQ1基因的表达量预测原发性痛风患病的阳性率为56.63%，诊断性能灵敏度为56.63%，特异度为65.43%；RFX3基因的表达量预测原发性痛风患病的阳性率为69.88%，诊断性能灵敏度为69.88%，特异度为60.49%。但是本研究选取的样本数量有限，不排除存在由此产生的结果偏差，此外，本研究只是研究广州地区的汉族原发性痛风患者，仅能代表广州地区汉族人群。因此，KCNQ1和RFX3基因表达在原发性痛风患者中的研究需要多中心，多地区进一步研究验证，并需要开展深入的功能研究以进一步揭示KCNQ1和RFX3基因参与原发性痛风发病的具体机制，从而提高人们对原发性痛风的认识并为原发性痛风的早期筛查及新药开发提供新的靶点及理论依据。近几十年来，中国人群整体水平的饮食结构发生了极大改变，脂类、糖类和蛋白类食物的摄取量明显提高，代谢综合征的发病率也逐步上升，这可能是营养和基因交互作用的结果，从而使中国人群的原发性痛风遗传呈现独有的特点。最重要的是部分影响血液尿酸水平的基因多态性位点具有群体特异性，因此可根据不同人群的遗传特点，开发有针对性的遗传标记和药物运用于临床诊断和治疗。

4 结 论

综上所述，中国特有KCNQ1和RFX3基因与广州地区原发性痛风患者易感性有密切相关。可能是通过影响单个核细胞中KCNQ1和RFX3基因的表达下调，使原发性痛风患者血脂和血糖升高，导致尿酸代谢异常引起无症状高尿酸血症，进一步发展成为原发性痛风，特别是KCNQ1和RFX3与原发性痛风发病相关，原发性痛风患者低表达KCNQ1和RFX3基因水平，RFX3对诊断原发性痛风比KCNQ1更灵敏，两基因可以作为临床预测发生原发性痛风患病的阳性率的较好指标。