多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性及耐药基因检测*

徐 益，王 佳，高 辉，朱雯梅，姚 瑶，方 尘

(昆明医科大学附属延安医院/云南心血管病医院检验科，云南昆明 650051)

鲍曼不动杆菌是一类条件致病的革兰阴性球杆菌，是导致医院感染的重要致病菌。近些年来随着广谱抗菌药物的大量使用及医疗侵入性操作的增加，鲍曼不动杆菌多重耐药及泛耐药菌株的检出率逐年升高，其感染率及临床致死率日趋严重[1]。产β-内酰胺酶是多重耐药鲍曼不动杆菌最重要的耐药机制[2]。国内外学者对鲍曼不动杆菌的耐药性及耐药基因分布进行了大量研究发现，由于地区差异性、医院治疗手段不同、从而使细菌面临的选择性压力不同，导致细菌耐药性的异质性。

本研究主要针对本院临床各科室分离的94株多重耐药鲍曼不动杆菌进行耐药性分析及研究耐药基因中具有代表性的D 类丝氨酸苯唑西林酶中的OXA-23型和A 类超广谱内酰胺酶中的TEM型，检测其阳性率，分析耐药表型与耐药基因的关系，以便更好地了解多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药情况及耐药基因在当地分布的流行情况，及时合理的指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集昆明医科大学附属延安医院2017年7月至 2018年12月各临床科室分离标本，筛选出其中的多重耐药鲍曼不动杆菌共94株进行试验。

1.2 仪器与试剂 全自动微生物鉴定/药敏测试系统及其配套试剂、抗菌药物纸片，Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 细菌DNA提取试剂盒、Oligo公司的引物、MASTERMIX、琼脂糖、DNA 标志物，水浴箱、离心机、电泳仪、PCR扩增仪、凝胶成像系统。

1.3 细菌鉴定及药敏实验 采用全自动微生物鉴定/药敏测试系统，适当补充药敏试验(K-B法和E-test)，药敏试验判断标准和结果解释参照美国临床和实验室标准协会标准，并用标准菌株做药敏质量控制。

1.4 耐药基因检测

1.4.1 DNA模板制备 用Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 细菌DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取鲍曼不动杆菌DNA。

1.4.2 PCR扩增 反应体系：1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，25 μL MASTERMIX，2 μL的模板，21 μL蒸馏水，反应体系总体积50 μL。引物由北京博迈德基因技术有限公司合成。引物序列:OXA-23上游5′-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3′，下游 5′-ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3′，产物长度501 bp；TEM上游 5′-ATC AGC AAT AAA CCA GC-3′，下游 5′-CCC CGA AGA ACG TTT TC-3′，产物长度516 bp。反应参数为:94 ℃ 预变性 5 min，然后 94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后 72 ℃延伸 5 min。

1.4.3 PCR产物分析 扩增完产物经2%琼脂糖凝胶，110 V×35 min电泳，放入凝胶成像系统扫描成像。电泳出现明亮的条带并且该条带与预期产物大小相同者送北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测序结果通过NCBI网站Blast比对分析，从而证实耐药基因。

2 结 果

2.1 多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性 多重耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类、头孢类和青霉素类的耐药率高达100.0%；对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为100.0%，对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别高达为97.6%、92.6%，92.7%和91.5%，对头孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米诺环素的耐药率分别为88.3%、87.2%和60.7%。多重耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性说明鲍曼不动杆菌对常规的抗菌药物普遍耐药，只对替加环素保持高度敏感，未检测出耐药菌株。见表1。

表1 多重耐药鲍曼不动杆菌耐药率分布(%)

2.2 耐药基因检测结果 通过观察琼脂糖凝胶成像上的阳性目的条带，计算得出携带OXA-23基因的多重耐药鲍曼不动杆菌为86株，其阳性率高达91.5%；携带TEM基因的多重耐药鲍曼不动杆菌为81株，阳性率为86.2%。阳性扩增产物进行测序，测序产物序列使用BLAST进行比对，结果显示PCR引物扩增出的产物序列与Genebank 发布的OXA-23、TEM基因序列相符。说明本院多重耐药鲍曼不动杆菌多数携带OXA-23、TEM型耐药基因。见图1、2。

图1 OXA-23 基因扩增产物电泳图像

图2 TEM 基因扩增产物电泳图像

2.3 耐药表型与耐药基因相关性 94株多重耐药鲍曼不动杆菌全部对碳青霉烯类、头孢类抗菌药物耐药，检测耐药基因OXA-23型为86株，未携带OXA-23基因的为8株，其阳性率高达91.5%；携带TEM基因为81株，未携带TEM基因的为13株，阳性率为86.2%。耐药表型和耐药基因检出情况基本一致。见表2。

表2 耐药菌株耐药基因分布情况

3 讨 论

鲍曼不动杆菌是一类非发酵革兰阴性杆菌，在医院环境及人体皮肤黏膜表面或与外界相通的腔道中广泛分布，因其具有极强的生存力和黏附力，常定植于医院的床旁仪器、被褥等非生物表面，可通过医务人员及器械传播，成为医院获得性感染的重要病原菌[3]。

鲍曼不动杆菌的耐药性日趋严重，特别是随着多重耐药鲍曼不动杆菌的出现，更是增加了临床选择抗菌药物方面的困难。中国2018年CHINET数据显示:不动杆菌属(鲍曼不动杆菌占92.9%) 对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别是73.7% 和 75.6%，而细菌对碳青霉烯类耐药即意味着对其他抗菌药物基本耐药，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。本研究中，昆明医科大学附属延安医院94株多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性数据显示，这些鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物广泛耐药，与文献[4-5]报道一致。对头孢类、青霉素类和碳青霉烯类抗菌药物的耐药率高达100.0%；对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、复方磺胺甲噁唑基本耐药，耐药率均超过90.0%，对头孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米诺环素的耐药率较高，分别为88.0%、87.5%和60.2%，多重耐药鲍曼不动杆菌只对替加环素保持高度敏感性，未检测到耐药菌株。抗菌药物中碳青霉烯类抗菌药物是抗菌谱广、抗菌活性强的一类抗菌药物，曾被作为是治疗多耐药鲍曼不动杆菌的首选药物[6]，但从本研究得出的数据，碳青霉烯类的耐药率已经达到了100.0%。仅有新型抗菌药物替加环素对其敏感性较高，但由于替加环素高昂的价格及其临床疗效不确定性，导致其并不能在临床治疗中广泛使用。

鲍曼不动杆菌耐药机制非常复杂，目前主要包括四方面：(1)产生抗菌药物的相关酶类；(2)膜通道蛋白的缺失或渗透性下降；(3)外排泵的过度表达；(4)药物作用靶位的改变[7-8]。鲍曼不动杆菌的耐药性常常是由其中一种或几种机制共同作用而导致[9]。本研究所检测的OXA-23和TEM分别属于产β-内酰胺酶中的D类酶苯唑西林酶和A 类超广谱内酰胺酶中最具代表性的酶类，同时OXA-23和TEM也属于多重耐药鲍曼不动杆菌中阳性率最高的酶[10]。研究结果显示检测的94株多重耐药鲍曼不动杆菌中，携带OXA-23基因菌株为86株，未携带OXA-23基因为8株，OXA-23阳性携带率为91.5%。根据抗菌药物敏感性实验，亚胺培南耐药率为100.0%，推测本院多重耐药鲍曼不动杆菌中携带OXA-23基因可能是导致亚胺培南耐药的原因；而检测TEM基因阳性菌株为81株，未携带TEM基因的为13株，阳性率为86.2%。结合其耐药表型结果，推测本院多重耐药鲍曼不动杆菌中携带TEM基因可能是导致哌拉西林和头孢类耐药的原因。多重耐药鲍曼不动杆菌对一线抗菌药物头孢类、青霉素类和碳氢霉烯类抗菌药物的耐药率已经达100.0%，耐药情况严重。本院多重耐药鲍曼不动杆菌多数携带OXA-23、TEM型耐药基因，其耐药基因与细菌耐药表型基本一致。但是由于鲍曼不动杆菌耐药机制的复杂性，其余未携带OXA-23与TEM基因导致的耐药可能与其他耐药机制有关，如膜通道蛋白的缺失或渗透性下，细胞外排泵过度表达等。

通过本研究发现，多重耐药鲍曼不动杆菌对多种抗菌药物广泛耐药，且多数菌株携带OXA-23、TEM基因，其携带耐药基因与耐药表现基本一致。鲍曼不动杆菌检出率不断增长，耐药形势日益严峻，临床上必须做好鲍曼不动杆菌的隔离及防护感控措施，并加强鲍曼不动杆菌耐药菌株的耐药性监测，才能减少耐药菌株的产生。对于本地多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性及耐药基因的研究还在不断的进展中，课题组将继续检测其他耐药基因，分析出耐药基因在当地分布流行情况，从而指导临床及时、合理有效的用药。