七肽TVNFKLY和LPQRLRT在儿童肺炎支原体肺炎中的诊断价值

张玲玲,李永玲,裴启慧

(青海省西宁市第二人民医院儿科，青海西宁 810003)

肺炎支原体在儿童中可引起高达40%的社区获得性肺炎[1]。但到目前为止，因为它有一些不寻常的症状[2]，导致肺炎支原体感染的早期诊断成为一个难点。肺炎支原体感染的实验室诊断基于血清学、培养和聚合酶链反应，但是它们各自都有特定的局限性[3]。SHI 等[4]通过噬菌体展示随机肽文库筛选了肺炎支原体的优势表位并获得两种七肽TVNFKLY和LPQRLRT。然而，噬菌体展示随机肽文库筛选的模拟表位可能不是病原体特异性，尽管它们具有各种肺炎支原体抗原同源性。因此，迫切需要对基于血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平的儿童肺炎支原体肺炎患儿诊断效能进行有效评估。基于此，本研究旨在探讨七肽TVNFKLY和LPQRLRT在儿童肺炎支原体肺炎中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年5月至2019年5月本院收治的儿童肺炎支原体肺炎患儿120例为支原体组；其中男66例，女54例，年龄2～10岁；平均(5.60±2.19)岁。非儿童肺炎支原体肺炎患儿120例为非支原体组；其中男63例，女57例，年龄2～11岁；平均(4.90±2.54)岁。儿童肺炎支原体肺炎患儿120例、非儿童肺炎支原体肺炎患儿120例均经本院病理科依据《实用儿科学》确诊。排除标准：(1)严重心、肝、肾功能损害者；(2)长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；(3)患有癌症者。另选取同期本院体检健康儿童120例为对照组；其中男64例，女56例，年龄2～11岁；平均(5.30±2.40)岁。各组一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，可纳入此次分析。受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附测定试验法(ELISA) 七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗体由Ontorespeptide公司合成。合成的anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT均为兔源，且能适用于ELISA法和蛋白质免疫印迹法。采取儿童肺炎支原体肺炎患儿120例、非儿童肺炎支原体肺炎患儿120例和体检健康儿童120例的肘前静脉血5 mL，进行ELISA检测(anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT)。

1.2.2 蛋白质免疫印迹法 使用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT抗体作为一抗、抗兔IgG为二抗(购自天津泰泽兴业生物科技有限公司，货号：656120)。使用电化学发光系统检测相应蛋白质[5]。

1.3 统计学处理 采用PRISM 7.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验。ImageJ软件定量分析免疫印迹条带。应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)分析七肽TVNFKLY和LPQRLRT检测儿童肺炎支原体肺炎的临床诊断价值。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组受试人员基础临床资料比较 儿童肺炎支原体肺炎患儿在年龄、男性比例、体质量指数与非儿童肺炎支原体肺炎患儿比较，差异无统计学意义(P>0.05)。支原体组患儿在年龄、男性比例、体质量指数与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组受试人员基础临床资料

2.2 各组受试人员血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比较 支原体组血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的水平高于非支原体组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。非支原体组和对照组儿童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比较

注：与非支原体组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

2.3 各组血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白条带比较 图1、2中使用七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗体再采用蛋白质免疫印迹法检测各组血清中的七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平，支原体组蛋白条带的灰度值明显高于非支原体组与对照组，而非支原体组与对照组的蛋白条带的灰度值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，支原体组血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的整体蛋白水平高于非支原体组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。非支原体组和对照组血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、2。

2.4 支原体组与对照组血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和截断值 为了评估血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT在支原体组与对照组诊断价值，绘制ROC曲线，见图3。七肽TVNFKLY的AUC为[(0.92±0.02),95%CI0.890 3～0.963 6]，以七肽TVNFKLY的阳性临界值为12.12 μg/mL，其诊断灵敏度为93%，特异度为90%；七肽LPQRLRT的AUC为[(0.91±0.01),95%CI0.873 2～0.953 3]，以七肽LPQRLRT的阳性临界值为7.987 μg/mL，其诊断灵敏度为89%，特异度为92%。见表3。

图1 各组血清中含七肽TVNFKLY蛋白条带

2.5 七肽TVNFKLY和LPQRLRT联合诊断儿童肺炎支原体肺炎 患有儿童肺炎支原体肺炎为真阳性，未患有儿童肺炎支原体肺炎为真阴性，以七肽TVNFKLY的阳性临界值12.12 μg/mL，七肽LPQRLRT的阳性临界值7.987 μg/mL为诊断界限，两者均满足则为联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT单向诊断儿童肺炎支原体肺炎的灵敏度分别为95.00%(114/120)和92.50%(111/120)，特异度分别为87.08%(209/240)和90.42%(217/240)，准确度分别为89.72%(323/360)和91.11%(328/360)。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT联合对儿童肺炎支原体肺炎的诊断的灵敏度为92.50%(111/120)，特异度为90.83%(218/240)，准确度为91.39%(329/360)。见表4。

图2 各组血清中含七肽LPQRLRT的蛋白条带

图3 支原体组与对照组血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲线

表3 支原体组与对照组血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的各指标比较

表4 七肽TVNFKLY和LPQRLRT诊断儿童肺炎支原体肺炎(n)

3 讨 论

肺炎支原体是导致儿童社区获得性肺炎的最常见病原体之一[6-10]。虽然儿童肺炎支原体肺炎通常被认为是一种自限性疾病，但有时它可能引起各种肺和肺外并发症，如闭塞性细支气管炎、坏死性肺炎、脑炎、关节炎、心包炎、溶血性贫血，并发展成严重的危及生命的肺炎。对于儿童，大环内酯类抗菌药物是儿童肺炎支原体感染的首选抗菌药物。然而，尽管大环内酯类抗菌药物治疗7 d或更长时间，仍有一些病例显示为难治性儿童肺炎支原体肺炎。因此，临床医生必须更早地识别儿童肺炎支原体肺炎并抓住合理治疗的适当机会。

本研究通过比较一般资料后通过ELISA检测儿童肺炎支原体肺炎患儿、非儿童肺炎支原体肺炎患儿和体检健康儿童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平并评价其联合诊断儿童肺炎支原体肺炎的价值，发现血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT联合对儿童肺炎支原体肺炎的诊断的灵敏度为92.50%，特异度为90.83%，准确度为91.39%。

使用噬菌体展示肽文库技术筛选的模拟表位可以模拟线性表位和构象表位，并且已经广泛用于许多疾病的诊断抗原或疫苗的开发，例如利什曼原虫，戊型肝炎病毒，狂犬病病毒[11-15]。七肽TVNFKLY和LPQRLRT是由噬菌体展示肽文库技术筛选的模拟表位。在本研究中，发现支原体肺炎患儿血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平高于非支原体组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，并且血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT单向诊断儿童肺炎支原体肺炎的灵敏度分别为95.00%和92.50%，特异度分别为87.08%和90.42%，准确度分别为89.72%和91.11%。七肽TVNFKLY与肺炎支原体的21种蛋白质具有高度同源性[4]，包括腺嘌呤特异性甲基转移酶、α/β水解酶、ATP依赖性伴侣ClpB、金属依赖性磷酸水解酶。同时，七肽LPQRLRT与8种肺炎支原体蛋白具有高度同源性，包括苏氨酸-tRNA连接酶、ABC转运蛋白、ATP结合蛋白。提示七肽TVNFKLY和LPQRLRT具有较高的灵敏度和特异度，对肺炎支原体感染的血清学诊断均具有临床价值。

在本研究中，支原体组血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平高于非支原体组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。非支原体组和对照组血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。尽管儿童肺炎支原体肺炎患儿血清中用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT检测到的蛋白质水平远远高于非支原体组和对照组，但是非支原体组和对照组的免疫印迹结果依旧有少许其他蛋白的存在。引起这现象的原因可能有两点：(1)本研究所使用的抗体可能特异性不高；(2)人类血清中可能含有TVNFKLY和LPQRLRT表位的非肺炎支原体蛋白质。

4 结 论

综上所述，血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平检测可作为诊断儿童肺炎支原体肺炎的潜在标志。