2019年北京地区某医院非结核分枝杆菌菌种鉴定结果分析

刘鑫梦，黎斌斌，王春雷，范艳艳，邹晓辉，熊祝嘉，赵建康，张玉林，李海波，夏雨頔，韩嘉静，叶雨菲，祝 越，鲁炳怀

(中日友好医院呼吸与危重症医学科二部临床微生物与感染实验室,北京 100029)

非结核分枝杆菌(NTM)病是指由NTM所引起的疾病，易继发于各类慢性肺病如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、尘肺和肺结核等，是人类免疫力低下时的常见并发症，如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者或长期使用免疫抑制剂者[1]。也是某些医院不严格执行消毒隔离制度，引起院内感染暴发流行的常见病原菌。本研究对2019年某综合医院临床微生物与感染实验室分枝杆菌培养阳性并鉴定为NTM的登记资料进行回顾性分析，旨在提高NTM病的诊疗水平，为相关科室NTM病的诊疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2019年本院临床微生物与感染实验室分枝杆菌培养阳性并鉴定为NTM的登记资料183份，患者多次培养阳性且鉴定结果相同，按1份统计。

1.2 仪器与试剂 全自动BACTECMGIT960系统，ABI7500荧光定量PCR仪；MGITTM 960液体培养试剂，博奥生物有限公司结核/NTM核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，牛津免疫技术有限公司结核感染T细胞检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 液体培养 将痰、支气管肺泡灌洗液等样本处理后，采用BD分枝杆菌培养管进行培养，仪器阳性报警后，取出等待核酸扩增检测。

1.3.2 NTM-DNA检测 取1 mL阳性培养物手动提取核酸，严格按照检测试剂盒说明书进行操作，并加入阴性、阳性对照。在保证实验有效的前提下，根据说明书判读结果。

1.3.3 分枝杆菌菌种鉴定 将DNA检测结果为NTM的核酸送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。采用16S rRNA(27F:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R:5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)和hsp65(hsp65-F:5′-ATC GCC AAG GAG ATC GAG CT-3′；hsp65-R:5′-AAG GTG CCG CGG ATC TTG TT-3′)基因测序。PCR扩增产物测序后NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 数据库比对，进行菌种鉴定。

1.3.4 IGRA检测 使用肝素抗凝的真空采血管采集外周静脉血，严格按照检测试剂盒说明书进行操作。阳性结果判读为空白对照孔斑点数为0～5个时，(抗原A或抗原B孔的斑点数)-(空白对照孔斑点数)≥6，空白对照孔斑点数为6～10个时，(抗原A或抗原B孔的斑点数)≥2×(空白对照孔斑点数)；如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“阴性”。

1.3.5 诊断标准 NTM病的诊断标准参照《非结核分枝杆菌病诊断与处理指南》[2]。

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件进行分析，计数资料组间比对采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2019年183份NTM培养标本菌株的鉴定结果 共鉴定NTM 17种,其中快生长分枝杆菌共6种，按数量排比前4位为脓肿分枝杆菌占12.0%(22/183)，男性占4.4%，女性占7.7%；偶发分枝杆菌占3.3%(6/183)，男性占1.6%，女性占1.6%；外来分枝杆菌占1.1%(2/183),女性占1.1%；产黏液分枝杆菌占1.1%(2/183)，男性1.1%；慢生长分枝杆菌共11种，按数量排比前4位为胞内分枝杆菌占54.6%(100/183)，男性占25.1%，女性占29.5%；鸟分枝杆菌9.3%(17/183)，男性占2.2%，女性占7.1%；堪萨斯分枝杆菌占4.4%(8/183)，男性占3.3%，女性占1.1%；副瘰疬分枝杆菌占3.3%(6/183)，男性占1.1%，女性占2.2%。快生长分枝杆菌共34株，慢生长分枝杆菌共149株，以胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌为主。

2.2 各年龄组不同性别感染NTM的构成比 患者根据年龄区间分为青年组(20～<45岁)19人，中年组(45～<65岁)67人,老年组(≥65岁)97人，各年龄组不同性别感染NTM的构成比见表1。

表1 各年龄组不同性别感染NTM的构成比[n(%)]

2.3 患者就诊类型、培养标本类型及患者人群疾病分布 183例患者中，住院患者例139例占76.0%，门诊患者44例占24.0%。送检样本类型痰126例占68.9%，支气管肺泡灌洗液44例占24.0%，组织6例占3.3%，胸腔积液2例占1.1%，其他5例占2.7%。送检的科室主要是呼吸科(包括肺移植科)占93.4%，其他送检科室包括风湿免疫科、细胞免疫治疗中心、外科重症监护室(SICU)、急诊科、感染科、肾病科及内分泌科。其中诊断为呼吸道相关性疾病的有173例，主要包括肺部感染、肺炎、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病、肺恶性肿瘤、肺脓肿等；其他疾病的10例，主要包括发热待查、狼疮性肾炎、胸腔积液、慢性咽喉炎、类风湿关节炎、皮肌炎、非霍奇金淋巴瘤等。

2.4 IGRA检测结果 183例患者中有IGRA结果的样本120例，阳性率27.5%(33/120)。按快生长分枝杆菌与慢生长分枝杆菌分类比较见表2。

IGRA结果阳性的患者中，快生长分枝杆菌阳性率为31.8%(7/22)；慢生长分枝杆菌阳性率为26.5%(26/98)，略低于快生长分枝杆菌的阳性率。快生长分枝杆菌与慢生长分枝杆菌IGRA结果的阴性率、阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.252，P=0.616)。

表2 快/慢生长分枝杆菌IGRA结果分析

3 讨 论

除结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌称为NTM，在自然环境中普遍存在，是一种条件致病菌，当患者免疫力低下时好发。近年来 NTM 发生率呈逐年上升趋势,已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题之一[3]。

本研究183份鉴定结果中，种群分布达17种，胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌占绝大多数(80.3%)。尽管NTM菌种分布在全球存在地理差异，但总体上仍以鸟分枝杆菌复合群(MAC)为主，而且MAC是引起NTM 肺病最常见致病菌。SIMONS等[4]研究显示，呼吸道分离的NTM菌种以MAC最常见，同时MAC的临床相关性也是最强的菌种(56.0%)，与本研究结果(63.9%)一致。

本研究从中分离出NTM的患者显示NTM可发生于青年至老年的任何年龄段，但好发于老年人[5]，同时免疫力下降是主要易感因素。本研究也显示，65岁以上人群是NTM的分离主体，提示中老年人群可因免疫力下降导致NTM感染率增高。但本研究老年人组分离出NTM的数据女性例数略多于男性，与其他报道结果不一致[5]，这可能与地区、人群不同或只从一家医院取样样本量较少导致。此类患者通常有慢性基础性肺疾病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病等。其他如患有恶性肿瘤、血液病、肾病、自身免疫性疾病或长期使用激素免疫力低下的患者。

本研究呼吸道标本比例较高(占93.4%)。其中痰(68.9%)、支气管肺泡灌洗液(24.0%)、肺穿刺组织(3.3%)，包括肺移植科送检的样本。在人体的实体器官移植(SOT)受者人群中，NTM感染的发生率大约为 1.5%～1.8%。其中，肺为NTM感染的主要部位，尤其是肺移植术后，在SOT受者人群NTM病中，约86%为NTM肺病[6-7]。近年来，随着免疫诱导治疗的临床应用日趋普遍，NTM 感染的发生率显著增加，NTM 病已成为 SOT 术后重要的感染性并发症之一[8]。SOT受者感染主要菌种为MAC、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和嗜血分枝杆菌等。本研究肺移植科6例中，胞内分枝杆菌4例(66.7%)，脓肿分枝杆菌2例(33.3%)，与《器官移植受者非结核分枝杆菌病临床诊疗技术规范》[9]相符。

本研究中183例样本中的120例曾检测IGRA，阳性33例(27.5%)。120例患者快生长分枝杆菌与慢生长分枝杆菌IGRA结果阴性率、阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.252，P=0.616)。IGRA是利用结核分枝杆菌感染者外周血单个核细胞中存在结核特异的效应T淋巴细胞，其再受到结核分枝杆菌特有的DNA片段所编码的ESAT-6和CFP-10刺激后分泌γ-干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验[10]。ESAT-6和CFP-10均位于结核分枝杆菌称为差异区域(RD1)的特定基因组区域。RD1存在于结核分枝杆菌复合群中，以及极少数NTM菌属中如海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、苏加分枝杆菌、戈登分枝杆菌等，感染者理论上可致IGRA阳性[11-12]。本研究中戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌阳性结果共4例，占这两种菌总人数的57.1%(4/7)。我国学者曾对含有RD1的NTM皮肤感染患者17例(15例海分枝杆菌、1例戈登分枝杆菌、1例苏加分枝杆菌)进行IGRA检测，其中12例阳性，阳性率70.6%，高于本研究的57.1%[13]。AUGUSTYNOWICZ-KOPEC等[14]的研究中，对结核病史阴性的61例患者进行IGRA检测，其中8%阳性；堪萨斯分枝杆菌分离株为22%，影像学提示既往结核病史为18%。IGRA阳性结果可能主要取决于过去无症状的结核感染。堪萨斯分枝杆菌与IGRA的交叉反应可能性较小，但是尚需进一步调查。结核分枝杆菌潜伏感染者或有既往结核病的患者在检测出NTM的同时，查出IGRA阳性，不能单纯认为是NTM导致IGRA阳性，还要结合病史、影像学检测等综合考虑。也有韩国学者认为，在结核高发地区，IGRA无法鉴别活动性结核、MAC与潜伏结核感染[15]。本研究样本量较少，比例波动较大，可能存在偏倚，有待于扩大样本进一步研究。

4 结 论

综上所述，本研究NTM所致感染中，以胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌为主要致病菌，尤其好发于年龄大于或等于65岁的老年人，IGRA结果对于NTM感染无明确诊断价值。