乌骨鸡快慢羽的ev21和dSPEF2/dPRLR分子标记检测

王欢欢，宋丹丹，葛 莹，张 雷，李庆海，章学东

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

鸡的羽毛长速(羽速)有快羽和慢羽之分，主要是指翼羽和尾羽等长出速度的快慢。快羽或慢羽在雏鸡出壳后即可看出：快羽鸡其主翼羽显著长于覆主翼羽；而慢羽鸡的主翼羽等于或短于覆主翼羽。研究表明，快慢羽属于伴性遗传性状，受Z染色体上的一对等位基因(k或K)所控制。快羽(k)相对于慢羽(K)为隐性，因此，用快羽公鸡(ZkZk)配慢羽母鸡(ZKW)，后代公雏表现慢羽(ZKZk)，母雏表现快羽(ZkW)，从而能实现雏鸡的自别雌雄[1,2]。

据研究，慢羽K基因通常携带有插入的内源性病毒基因21(ev21基因)，但也有少数慢羽鸡种不存在ev21基因插入。同时，慢羽K基因还可能包含由SPEF2基因和PRLR基因的非编码区融合组成的重复片段(dSPEF2/dPRLR基因)[3-5]。ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因均为快慢羽研究的重要候选基因，因此，本试验开展了乌骨鸡群体的快慢羽分型以及ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的检测，通过了解乌骨鸡的快慢羽分子结构特点，为乌骨鸡的新品系培育提供参考。

1 材料与方法

1.1试验材料 选择了由杭州市农业科学研究院保存的HW1系黑羽乌骨鸡，在1日龄时，对756羽健康雏鸡进行羽速观察，区分快羽和慢羽鸡并佩戴相应翅号。

1.2样品采集与DNA提取 在90日龄时，采集快羽和慢羽鸡各40羽的翅静脉血液。按照Axygen动物血液DNA试剂盒说明书提取鸡血液基因组DNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

1.3扩增引物 参考Takenouchi[5]文献分别设计用于扩增Z染色体上ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的引物。引物交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.4双重PCR反应 PCR反应体系为：DNA 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，F、IN、R引物分别为0.5 μL、0.3 μL、0.3 μL，加水补至 25 μL。上ABI 9700型PCR仪(ABI，美国)进行扩增。ev21基因的PCR反应程序为：94℃，5 min；然后进入PCR循环，94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。dSPEF2/dPRLR基因的PCR反应程序为：94℃，5 min；然后进入PCR循环，94℃，30 s，55℃，2 min，72℃，30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。将PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)拍照。

表1 引物信息

2 结果与分析

2.1乌骨鸡雏鸡快慢羽分型 在1日龄时，对756羽健康雏鸡进行羽速观察结果显示：HW1系乌骨鸡的快羽和慢羽鸡比例分别为72.2%和27.8%。慢羽中存在倒长型、未长出型和等长型三种类型，其中等长型比例最高，未长出型比例小于5%。

注：A快羽型，B倒长型，C未长出型，D等长型图1 雏鸡快慢羽鉴别情况

2.2乌骨鸡ev21基因插入检测 ev21基因的PCR扩增产物电泳后，慢羽乌骨鸡样本有ev21片段插入出现396 bp和341 bp两条带，快羽乌骨鸡仅出现396 bp一条带。

1、2、3为慢羽鸡，4、5、6为快羽鸡，M为DL2000标志物图2 ev21基因插入检测

2.3乌骨鸡dSPEF2/dPRLR融合基因检测 dSPEF2/dPRLR基因的PCR扩增产物电泳后，慢羽乌骨鸡样本出现1950 bp和1437 bp两条带，即慢羽乌骨鸡Z染色体上有dSPEF2/dPRLR融合基因片段，而快羽乌骨鸡仅出现1950 bp一条带，无融合基因片段插入。

1、2、3为慢羽鸡，4、5、6为快羽鸡，M为DL2000标志物图3 dSPEF2/dPRLR融合基因插入检测

2.4基因分型与鉴雏分型的一致性 40羽快羽鸡和40羽慢羽鸡的ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因PCR分型结果与出雏时的羽速观察分型结果基本一致，仅有1羽慢羽鸡的Z染色体上没有检测到ev21位点插入。

表2 出雏判断与基因检测对照表

3 讨论与结论

Bacon[6]在DNA水平上证实了慢羽基因K与内源性病毒ev21紧密连锁，并认为ev21的插入，造成雏鸡羽毛生长速度缓慢。但Boulliou等[7]在商品蛋鸡的快慢羽基因型研究结果表明ev21座位不是决定慢羽表型的唯一因素。Elferink等[2]研究表明慢羽鸡的K基因还包含PRLR和SPEF2 及其部分重复的 dPRLR和dSPEF2基因。Takenouchi等[5]对52个鸡种开展研究发现，几乎所有的快羽鸡中都没有ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因；除了Ingie品种慢羽鸡中没有ev21基因插入，其余慢羽鸡Z染色体上都检测到ev21和dSPEF2/dPRLR基因。本实验中，乌骨鸡快羽样品都没有检测到ev21和dSPEF2/dPRLR基因，这与多数快羽鸡种的结果一致。dSPEF2/dPRLR基因是PRLR基因的第1-11外显子、第12外显子的558 bp处和SPEF2基因的第1-5外显子重复拼接形成[3,8]。Bu等[9]研究认为PRLR有多个启动子，慢羽鸡中表达的dPRLR比正常的PRLR蛋白在尾部少149个氨基酸。在小鼠中研究表明，敲除PRLR基因小鼠可改变毛发生长周期，敲除小鼠毛发比野生型的毛发稍长且较粗。这些发现表明PRLR对毛发周期具有抑制作用[10]。赵计昌研究发现融合基因或dPRLR仅在慢羽鸡中转录表达。SPEF2基因在慢羽鸡皮肤组织中的表达量显著高于快羽鸡[11]。本研究在慢羽鸡Z染色体上均检测到dSPEF2/dPRLR基因，也显示了乌骨鸡dSPEF2/dPRLR基因与慢羽性状连锁更紧密。

目前，在国外引进的海兰、罗曼和白来航鸡等商品鸡种中已广泛采用快慢羽配套系，占据了蛋(肉)鸡的主流市场。国内也有一些研究机构或公司开展了地方品种快慢羽系的选育以及配套杂交。本试验结果表明，HW1系乌骨鸡中存在快慢羽性状，慢羽鸡的K基因上同时含有ev21插入基因和融合基因dSPEF2/dPRLR。因此，在乌骨鸡快慢羽新品系的开发中，可以利用ev21和dSPEF2/dPRLR基因检测等分子方法来辅助选育，提高准确性，加快育种进程。