电针对不同阶段SAMP8小鼠学习记忆能力及海马区突触素和突触后致密物-95表达的影响

赵恩聪　郑家勇　郭婉清　洪苗苗　林岚　王丰　董卫国

摘要：目的  觀察电针对不同阶段SAMP8小鼠学习记忆能力及海马区突触素（SYN）和突触后致密物-95（PSD-95）表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病的最佳时机。方法  SAMP8小鼠48只随机分成模型组、3月龄电针组、6月龄电针组和9月龄电针组，每组12只，同龄正常老化SAMR1小鼠12只为对照组。电针组均选取“百会”“大椎”“肾俞”，电针频率为2 Hz，每日1次，8 d为1个疗程，每个疗程间隔2 d，共3个疗程。运用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化和Western blot检测海马突触相关蛋白SYN和PSD-95的表达。结果  与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，原平台象限停留时间明显缩短，跨越原平台次数明显减少，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），海马区SYN和PSD-95蛋白表达明显下降（P<0.01）;与模型组比较，各电针组小鼠逃避潜伏期明显缩短，原平台象限停留时间明显延长，跨越原平台次数明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），海马区SYN和PSD-95蛋白表达均明显升高（P<0.01），且均以3月龄电针组最显著（P<0.05，P<0.01）。结论  电针能提高SAMP8小鼠学习记忆能力，促进海马区SYN、PSD-95蛋白的表达，改善突触功能。

关键词：阿尔茨海默病;电针;学习记忆;突触素;突触后致密物-95;SAMP8小鼠

中图分类号：R245    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）03-0048-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908294

Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability and Expressions of Hippocampal Synaptophysin and PSD-95 in SAMP8 Mice at Different Stages

ZHAO Encong1， ZHENG Jiayong2， GUO Wanqing3， HONG Miaomiao1， LIN Lan4， WANG Feng4， DONG Weiguo4

1. College of Acupuncture and Moxibustion， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China; 3. The Third Peoples Hospital of Fujian Province， Fuzhou 350108， China; 4. College of Integrated Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture on learning and memory ability and expressions of synaptophysin （SYN） and postsynaptic density-95 （PSD-95） in the hippocampus of SAMP8 mice at different stages; To explore the optimal time of electroacupuncture in the treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Totally 48 SAMP8 mice were randomly divided into model group， 3-month-old electroacupuncture group， 6-month-old electroacupuncture group and 9-month-old electroacupuncture group， with 12 mice in each group. 12 SAMR1 mice of the same age and normal aging were set as control group. In the electroacupuncture group， Baihui （GV20）， Dazhui （GV14） and Shenshu （BL23） acupoints were selected. The electroacupuncture frequency was 2 Hz， once a day， and 8 days was a course of treatment， with a course interval of 2 days. There were 3 courses of treatment in total. Morris water maze experiment was used to test the learning and memory ability of mice in each group， and the expression of hippocampal synapse related proteins SYN and PSD-95 was measured by immunohistochemistry

and Western blot. Results Compared with the control group， the escape latency of the model group was significantly prolonged， the residence time of the original platform quadrant was significantly shortened， and the number of crossing the original platform was significantly reduced， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. The expression of SYN and PSD-95 protein in hippocampus of model group significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the escape latency of the mice in each electroacupuncture group was significantly shortened， the residence time of the original platform quadrant was significantly prolonged， and the number of crossing the original platform significantly increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. The expressions of SYN and PSD-95 protein in hippocampus of mice in each electroacupuncture group significantly increased （P<0.05， P<0.01）， and were most significant in the 3-month-old electroacupuncture group （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice， promote the expressions of SYN and PSD-95 in the hippocampus， and improve the synaptic function.

Keywords： Alzheimer disease; electroacupuncture; learning and memory; synaptophysin; postsynaptic density-95; SAMP8 mice

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种起病隐匿且与年龄相关的退行性神经系统疾病，主要表现为进行性认知功能退化、记忆丧失和行为障碍等。其早期突出的病理特征为神经元的丢失与突触损伤[1-2]。近年来，突触功能在AD防治中备受重视，保持突触的稳态平衡可能是AD治疗的新策略[3]。研究表明，电针能增强SAMP8小鼠突触功能[4-5]，但目前关于电针治疗AD时机的研究报道较少。故本实验对3、6、9个月不同月龄SAMP8小鼠进行电针治疗，运用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化和Western blot检测与突触可塑性密切相关的突触素（synaptophysin，SYN）和突触后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）的表达，从突触可塑性角度探讨电针治疗AD的时机。

1  实验材料

1.1  动物

SAMP8小鼠48只及SAMR小鼠12只，3月龄，雄性，体质量20～25 g，北京大学医学部（实验动物科学部），动物许可证号SCXK（京）2011-0012。饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，小鼠购入后均适应性饲养1周，温度22～24 ℃，相对湿度50%～60%，明暗周期12 h，自由摄食饮水。实验过程严格按国际动物保护及使用指南进行，按实验动物3R原则给予人道关怀。

1.2  主要试剂与仪器

兔单克隆抗体SYN（批号ab32127），Abcam公司;兔多克隆抗体PSD-95（批号18258），Abcam;β-actin（批号20536-1-AP），Proteintech公司;生物素标记的羊抗兔IgG、DAB试剂盒，福州迈新生物工程有限公司;Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，Bio-Rad图像分析系统。G6805-Ⅰ电针治疗仪，青岛鑫升实业有限公司;0.25 mm×15 mm华佗牌无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。

2  实验方法

2.1  分组及干预

将48只SAMP8小鼠随机分为模型组、3月龄电针组、6月龄电针组和9月龄电针组，每组12只，另取12只SAMR1小鼠作为对照组。电针组采用自制网兜固定小鼠，选取“百会”“大椎”“肾俞”，参照《实验针灸学》[6]取穴。“百会”位于小鼠顶骨正中，“大椎”位于背部第7颈椎与第1胸椎间，“肾俞”位于第2腰椎下两旁。操作方法：“百会”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“腎俞”稍向内斜刺3～4 mm，其中“大椎”“肾俞”给予电针刺激，“肾俞”双侧隔日交替。连续波，频率2 Hz，电流强度以引起小鼠后肢肌肉轻微颤动而不嘶叫为宜。每次20 min，每日1次，8 d为1个疗程，每个疗程间隔2 d，共3个疗程。全部小鼠由3月龄饲养至9月龄，模型组和对照组除不进行电针治疗，其余抓取和固定方式相同，水迷宫实验后统一取材。

2.2  Morris水迷宫实验

治疗结束后，均在10月龄运用Morris水迷宫视频分析系统检测小鼠空间学习记忆能力。定位航行实验：将平台置于第三象限中间，水面高于平台约1 cm，分别从4个象限筒壁中点放入小鼠，记录小鼠90 s内找到平台时间，即为逃避潜伏期，连续记录5 d。空间探索实验：第6日撤掉平台，将小鼠从第一象限放入，记录90 s内小鼠跨越原平台时间及次数。

2.3  免疫组化检测突触素和突触后致密物-95蛋白表达

每组取6只小鼠，麻醉后灌流固定。取全脑修块后放入4%多聚甲醛内，固定24～48 h。将脑组织石蜡包埋，切片，制片。分别加入SYN抗体（1∶700）和PSD-95抗体（1∶200），湿盒孵育过夜。加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗，DAB显色，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察每张玻片海马CA1区3个阳性染色区域，以棕黄色作为阳性判断标准，在同一光源、光圈、色彩饱和度和对比度等相同条件下，拍照采集图片。用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对海马CA1区SYN及PSD-95图片进行分析，计算SYN及PSD-95的平均光密度（MOD）值。

2.4  Western blot检测突触素和突触后致密物-95蛋白表达

每组取6只小鼠进行麻醉，灌注后快速断头取脑，分离出完整海马，-80 ℃保存，称海马湿重，裂解后取上清液，BCA法测上清液浓度。蛋白样品用10%SDS-PAGE进行电泳，300 mA转蛋白质至PVDF膜上。封闭2 h后，加入SYN抗体（1∶8000）、PSD-95抗体（1∶1000）、抗小鼠β-actin（1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤;加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室温孵育2 h，TBST洗涤。配制显色液并覆PVDF膜1 min后进行图像扫描，Bio-Rad图像分析系统分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对灰度。

3  统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，水迷宫定位航行空间探索结果采用重复测量方差分析，其他结果采用方差分析，组间比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  Morris 水迷宫实验结果

与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，原平台象限停留时间明显缩短，跨越原平台次数明显减少，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，各电针组逃避潜伏期缩短，原平台象限停留时间延长，跨越原平台次数增加，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与9月龄电针组比较，6月龄电针组逃避潜伏期缩短，原平台象限停留时间延长，跨越原平台次数增加（P<0.05）;与6月龄电针组比较，3月龄电针组逃避潜伏期明显缩短，原平台象限停留时间明显延长，跨越原平台次数明显增加（P<0.05，P<0.01）。结果见图1、表1和表2。

4.2  免疫组化染色结果

SYN主要表达于海马CA1区神经元细胞膜、细胞质，PSD-95主要表达于神经元细胞膜。与对照组比较，模型组小鼠SYN和PSD-95阳性表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各电针组MOD值均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且3月龄电针组MOD值明显高于6月龄和9月龄电针组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2～图4。

4.3  Western blot檢测结果

与对照组比较，模型组小鼠SYN和PSD-95蛋白表达显著降低（P<0.01）;与模型组比较，各电针组小鼠SYN和PSD-95蛋白表达均明显升高（P<0.05，P<0.01），且3月龄电针组SYN与PSD-95表达量明显高于6月龄和9月龄电针组（P<0.01）。结果见图5。

5  讨论

AD属中医学“痴呆”“呆证”范畴，其病机为肾精亏虚、髓海不足、脑失所养，治疗以补肾益髓、开窍醒脑为主。《医经精义》云：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精。益肾生精化为髓而之于脑中。”《医林改错·脑髓说》述：“小儿无记性者，脑髓未满;年高无记性者，脑髓渐空。”均明确指出肾精化髓、髓上输脑是记忆的物质基础。《杂病源流犀烛》有“督脉为精气升降之道路”，故督脉是肾气精微输布于脑的关键通道，具有调节机体意志精神和增强思维活动的重要作用。百会属督脉，深处为脑，有益智健脑、开窍醒神之功。大椎为督脉要穴，又与手足六阳经交会，具有通督开窍、振阳升清、调神醒脑的功效。肾俞属足太阳膀胱经，相表里于足少阴肾经，可补肾益髓、益气调督。百会、大椎、肾俞三穴配伍，以达醒脑开窍、益肾调督之效。研究表明，针刺“百会”“肾俞”能有效减少AD模型老年斑聚集，益肾调督法可调节炎症因子失衡状态，有效改善AD炎症反应[7-8]。上述文献与课题组前期研究[4-5，9]均证实益肾调督法对AD有良好疗效。

研究表明，AD早期出现的认知障碍与突触功能受损及突触丢失密切相关[2，10]。SYN是一种特异性存在于突触囊泡膜上的钙结合糖蛋白，可反映突触的分布和密度，SYN磷酸化可影响突触功能，SYN通过调节轴突和树突的分化及生长，影响突触结构，是研究突触可塑性的重要指标。PSD-95是突触后膜致密区上一种支架蛋白。PSD-95可簇集谷氨酸受体和NMDA受体，影响递质传递，同时还参与突触的连接和维持，进而影响突触可塑性。突触是信息传递的枢纽及功能蛋白的密集之地。突触可塑性是神经可塑性最主要的形式，是学习和记忆的神经生物学基础。姚柏春等[10]发现，Aβ可诱导大鼠海马SYN含量减少，随之突触密度和突触联系也出现下降，进而导致递质传递发生障碍。Migaud等[11]研究显示，小鼠PSD-95基因被敲除后，其大脑神经元突触长时程增强作用发生变化，小鼠学习记忆出现功能性障碍。可见，海马SYN、PSD-95蛋白表达水平与突触可塑性关系密切。

本研究以快速老化模型小鼠亚系SAMP8小鼠为AD模型，设计3月龄、6月龄、9月龄电针组，分别代表AD早期、中期、晚期3个阶段。SAMP8模型广泛用于AD研究，其特点是4～5月龄开始出现认知损害及行为异常，6月龄SAMP8小鼠脑内海马区即有大量Aβ异常沉积，并随月龄增加损伤进一步加重[12]。本实验结果显示，各电针组均能上调SYN和PSD-95蛋白的表达，提示电针能增强突触功能，这可能是改善SAMP8小鼠学习记忆能力的机制。且电针治疗越早，海马SYN、PSD-95表达水平越高，提示电针对AD的改善程度与治疗时机相关，早期疗效优于中期和晚期。

中医“治未病”思想源于《黄帝内经》，形成于《伤寒杂病论》。对AD诊治的指导思想是“疾病未生、疾病未发”之时，本质与现代医学“早预防、早诊断、早治疗”的原则相统一。2011年提出的NIA-AA标准，将AD分为3个阶段，即无症状临床前AD阶段、痴呆前有症状阶段及痴呆阶段[13]。临床事实证明，一旦AD进入轻度认知损害阶段，就会发生不可逆转的认知损害，只有早于轻度认知损害阶段疾病干预才有价值[14]。本实验结果显示，3月龄即早期电针组治疗AD疗效最优，此结果契合中医“治未病”理论。

综上所述，AD早期电针介入能明显改善SAMP8小鼠学习记忆能力，提高海马SYN、PSD-95蛋白的表达水平，改善突触功能，其疗效优于AD中、晚期电针治疗。这一结果为电针治疗AD时机的选择提供了思路，而关于早期介入电针疗效优于中、晚期的作用机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2019-08-20）

（修回日期：2019-09-20;编辑：华强）