高半胱氨酸-罗丹明探针可视化检测水溶液中Hg2+

李爱玲，赵秋媛，周丽波，杨 敏，张艳丽，张丽珠，王红斌

(1.云南民族大学 化学与环境学院，云南 昆明 650500； 2.云南民族大学 民族医药学院，云南 昆明 650500)

Hg2+是一种极具生理毒性的化学物质, 溶解态的Hg2+往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽.它对于人体蛋白中的硫醇组织和一些酶类都有非常高的亲和性，从而导致不同的严重疾病，人类主要通过自然界的水接触到汞污染[1],危害人类的中枢神经系统、肾脏、口腔以及皮肤等，甚至引起死亡[2-3].它具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性[4],且毒性很大极易挥发，给生态系统带来较大的污染[5].所以，汞元素被列入全球环境监控系统中，其在生物体内及环境中的检测方法受到人们的极大关注.因此，开发操作简便、选择性好、灵敏度高且成本低廉的汞离子检测方法有非常重要的意义[6].

目前，检测Hg2+的方法较多，但这些分析方法存在着操作方法复杂、测试时间长、需用到大型仪器等缺点[7].紫外-可见吸收光谱，统称为电子光谱，是材料在吸收10～100 nm光波波长范围的光子所引起分子中电子能级跃迁时产生的吸收光谱.紫外-可见吸收光谱法具有操作简便、快速，灵敏度高[8-9]，运用与测量范围广泛，仪器简单价格相对较低，易于普及推广等特点[10].高半胱氨酸又称同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物[11]，是维持细胞和组织生长，以及生物氧化还原平衡的重要物质[12]，血液中 Hcy 的浓度水平被认为是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子.罗丹明类探针技术近年来发展迅速，且罗丹明类化合物具有高摩尔消光系数、高荧光量子产率、良好的光稳定性以及较宽的波长范围等光学性质，特别是对其进行结构修饰后得到的螺环结构罗丹明衍生物更具研究前景[13].

本文通过引入含有亲汞基团的高半胱氨酸，合成了探针Hcy-Rh6G2，建立了一种对汞离子的可视化检测，且当CH3OH/HEPES的体积比在 1∶1时，紫外吸收强度已经接近最大.利用紫外-吸收光谱研究其对Hg2+的识别过程，发现对Hg2+的识别效果很好.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂

二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氧化铝粉、探针分子Hcy-Rh6G2在文献[14]中合成，所有试剂均为分析纯.

1.1.2 实验仪器

UV2100紫外-可见分光光度计(日本SHIMADZU公司)；AV 400V核磁共振仪(BRUKER)；EF20 pH酸度计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SHZ-D循环水真空泵(巩义市予华仪器有限公司).

1.2 实验过程

1.2.1 探针的性能测试

取Hcy(0.1 mmol/L)溶液 2 mL加入到装有 2 mL 化合物RS1(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反应瓶中，中间体RS1按文献[15]报道的方法合成.再往里面加入 2 mL化合物Rh6G2(0.1 mmol/L)，将他们混匀后在常温下反应 2 h，用于测试.测试的激发狭缝宽度为 2.5 nm、发射狭缝宽度为 2.5 nm、激发波长为 510 nm、电压为 400 V，探针的紫外-可见吸收光谱在HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH=7.00)的缓冲溶液中测试.

1) 不同缓冲溶液中对Hg2+的检测.在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)缓冲相中，加入 25 μmol/L的Hg2+，量为荧光溶液的20倍，其他条件都一致，反应 24 h,测定溶液的紫外-可见吸收光谱.

2) 离子选择性实验.通过紫外-可见吸收光谱检测探针对金属离子的选择性识别，将溶液的pH值调整为7，加入3.996 mL浓度为50 mmol/L的HEPES缓冲液，在7.996 mL CH3OH/H2O(V/V约1∶1)溶液中分别加入40 μL Cu2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、Ni2+，Fe2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和 400 μL的Hg2+金属离子溶液，摇匀后，放置 24 h进行识别检测.

3) 不同浓度的Hg2+对探针Hcy-Rh6G2紫外-可见吸收光谱的影响.取Hcy(0.1 mmol/L)水溶液 2 mL加入到装有 2 mL Rh6G2(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反应瓶中，进一步将Hcy和Rh6G2稀释成浓度为 50 μmol/L，常温下反应 2 h后，加入 3.996 mL浓度为50 mmol/L的HEPES缓冲液，并逐渐增大Hg2+的浓度，摇匀后，放置 24 h，测定溶液的紫外-可见吸收光谱.

4) 阴、阳离子的干扰实验.为了研究其他常见阴、阳离子对Hg2+的影响，进行了其他常见阴、阳离子的干扰实验，分别加入其他常见离子和Hg2+到7.996 mL(VCH3OH:VH2O=1∶1)溶液中，放置 24 h，检测体系的紫外-可见吸收光谱.

2 结果与讨论

2.1 分子探针Hcy-Rh6G2性能研究

2.1.1 不同缓冲溶液对探针Hcy-Rh6G2紫外-可见吸收光谱的影响

不同缓冲溶液对探针Hcy-Rh6G2的紫外-可见吸收光谱影响进行了测试，在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)缓冲相中，加入Hg2+的量为荧光溶液的20倍25 μmol/L，反应 24 h，测定溶液的紫外-可见吸收光谱.结果表明，如图1所示，Hg2+在HEPES缓冲相中产生粉红色荧光，在水相中和Tris-HCl缓冲相中几乎没有颜色变化.不同缓冲相下探针Hcy-Rh6G2对汞离子检测的紫外吸收谱如图2所示，Hg2+在HEPES缓冲相中可以引起探针紫外吸收光谱的明显变化，吸收光谱强度最大，在水相中有较弱的吸收光谱产生，而在Tris-HCl缓冲相中几乎无变化，说明HEPES缓冲相下探针Hcy-Rh6G2能够更好的识别Hg2+.

2.1.2 探针Hcy-Rh6G2的离子选择性

Rh6G2的醛基与Hcy反应形成经典的希夫碱结构，因分子内巯基较长的烷基链所产生的空间位阻导致Hcy不能与醛基顺利发生环化反应诱导Rh6G2分子开环.当探针Hcy-Rh6G2加入Hg2+后，放置 24 h，如图3所示.其中VCH3OH∶VH2O=1∶1,激发波长为 510 nm.Hg2+可以引起探针紫外吸收光谱的明显变化，吸收强度增加最大，加入其他常见金属离子，除Co2+的吸收强度有略微变化外，其它的紫外吸收强度几乎为零，表明探针分子Hcy-Rh6G2对Hg2+具有相对较高的离子选择识别性能.

2.1.3 不同浓度的Hg2+对探针Hcy-Rh6G2的紫外-可见吸收光谱的影响

不同浓度的Hg2+对探针Hcy-Rh6G2紫外-可见吸收光谱的影响也进行了测试，未加入Hg2+时，探针的紫外吸收强度几乎为0，表明此时探针为闭环状态.如图4所示，加入Hg2+后，在 528 nm处出现一个新的特征峰，且紫外吸收强度随Hg2+浓度的增大而增强，表明探针和Hg2+已经完全反应，螺旋胺环已经全部被打开，溶液颜色也由无色渐变成紫红色.如图 5所示，紫外吸收强度的增幅与Hg2+浓度呈线性关系，线性回归方程为A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3),其中c为Hg2+的摩尔浓度，A为吸光度.

2.1.4 其它阴阳离子的干扰

为考察其它金属阳离子和阴离子对探针Hcy-Rh6G2识别Hg2+的影响，还进行了其它金属阳离子和阴离子的干扰实验.在浓度为25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入浓度为0.1 mol/L的其它阴离子(Br-, I-, CO23, H2PO2-4, HPO-4, PO3-4, NO-2, NO-3, S2O2-3, SO2-3, SO2-4, HSO-3, HSO-4)40 μL后，如图6所示，波长为528 nm处,紫外吸收强度几乎没变化，之后再加入Hg2+，紫外吸收强度显著增强，除I-,Br-, 外，加入其他阴离子后探针的紫外吸收强度的增幅与单独加入Hg2+后探针的紫外吸收强度的增幅相同，表明其他阴离子的存在未干扰探针对Hg2+的检测.I-,Br-的加入使得探针的紫外吸收强度下降，是因为I-与Hg2+形成了四面体型[HgI4]2+,从而使Hg2+无法正常与RS1结合所致，从而使紫外吸收强度下降.

在浓度为25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入浓度为 0.1 mol/L的其他金属阳离子40 μL后，如图7所示，波长528 nm处紫外吸收强度几乎没变化，之后再加入Hg2+，紫外吸收强度显著增强，加入其他金属阳离子后探针的紫外吸收强度的增幅与单独加入Hg2+后探针的紫外吸收强度的增幅相同，表明其他金属阳离子的存在未干扰探针对Hg2+的检测.是由于Fe3+的顺磁性导致吸收强度淬灭.

2.2 溶剂体系(CH3OH:HEPES)的比例对反应的影响

从紫外吸收强度上看，如图8在纯甲醇或者随HEPES缓冲液的量增加时，体系的紫外吸收强度逐渐增强，当CH3OH/HEPES的体积比在 7∶1～4∶4之间时，体系的紫外吸收强度较强.其中，当CH3OH/HEPES的体积比在1∶1时，紫外吸收强度已经接近最大.

2.3 探针Hcy-Rh6G2对Hg2+识别机理研究

为了探究探针Hcy-Rh6G2和Hg2+反应机制的可能性，先将Hg2+加入到探针溶液中，打开探针内酰胺结构，形成较大的共轭体系分子，产生了荧光，再加入过量的络合剂EDTA，荧光强度几乎无明显变化，表明此识别过程不可逆，且体系中有水参与反应，证明此识别过程可能与水解有关.如图9所示，通过水解产物的质谱分析发现，Q-TOFMS：([M+H])+理论值：415.20，观测值：415.2013(m/z)的信号.

3 结语

本文通过引入高半胱氨酸，合成了探针Hcy-Rh6G2，利用紫外-吸收光谱研究其对Hg2+的识别过程.通过紫外光谱法研究结果表明，探针分子Hcy-Rh6G2在HEPES缓冲溶液中能快速、高选择性的识别Hg2+，当CH3OH/HEPES的体积比在1∶1时，紫外吸收强度已经接近最大，具有较强的抗金属阳离子和阴离子的干扰能力，并能通过溶液颜色变化实现对汞离子的感官识别，在2.50×10-5～2.250 0×10-4mol/L浓度范围内，紫外吸收强度的增幅与Hg2+浓度呈线性关系，线性回归方程为A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3)，可应用于实际样品中Hg2+的检测.