203 株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床分布特征及耐药基因型分析

佘亚辉，韩媛媛，柴杰，荣令

碳青霉烯类抗菌药物是治疗由多重耐药肠杆菌科细菌引起的感染的有效药物，尤其适用于产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）和AmpCβ内酰胺酶（AmpC酶）的病原菌引起的严重感染。然而，世界范围的碳青霉烯类耐药正挑战着碳青霉烯类抗生素用于严重感染的治疗［1-3］。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）的出现，引发了全世界的关注［4］。为了解医院CRE 细菌的分布和耐药情况，本研究通过对CRE菌株进行统计分析，并采用分子生物学方法检测耐药基因在CRE菌株中的表达，对CRE细菌分布及耐药特点进行总结，为指导临床合理选择抗菌药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2016 年1 月至2018 年9 月亳州市人民医院门诊及住院病人分离的非重复耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌203 株，采用Vitek 2-Compact 全自动微生物分析仪进行鉴定，金黄色葡萄球菌ATCC25923 和大肠埃希菌ATCC25922 为质控菌株（本室保存）。因本研究主要涉及细菌学故免除了医院伦理委员会的审查。

1.2 主要仪器和试剂 全自动微生物分析仪（法国梅里埃生物公司），DNA提取试剂盒（宝生物工程有限公司），实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），SYBR Green 荧光染料（美国ABI公司），电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。参照文献［5］设计引物，并由上海生工生物技术有限公司合成，见表1。

表1 碳青霉烯酶耐药基因PCR引物序列及产物长度

1.3 细菌鉴定和药物敏感性试验 采用Vitek 2-Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统对细菌进行鉴定及药敏分析。抗菌药物包括：呋喃妥因、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢曲松、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、头孢替坦、头孢他啶、氨苄西林、哌拉西林、妥布霉素、磺胺甲唑、丁胺卡那霉素、氨曲南、庆大霉素和氨苄西林/舒巴坦。以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株，结果判断和分析参照2012 年CLSI 颁布的标准进行。改良Hodge试验参照文献［6］进行。

1.4 荧光定量PCR 扩增碳青霉烯酶耐药基因 采用DNA 提取试剂盒提取CRE 菌株基因组DNA，根据表1中的引物，采用SYBR Green 染料法进行实时荧光定量PCR 检测碳青霉烯酶耐药基因，配制20µL 反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10µL，正向引物（10 µmol/L）1.0 µL，反向引物（10µmol/L）1.0µL，cDNA 2µL，ddH2O 6.0µL，总计20µL。反应条件：94 ℃，10 min，1 个循环。94 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40 个循环。待扩增反应结束后，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为循环阈值（Cycle threshold，Ct），并调节阈值范围判断结果，以Ct值＜35判断为阳性表达。

2 结果

2.1 CRE 细菌检出率 从2016 年1 月至2018 年9月对我院分离出的肠杆菌科细菌进行耐药分析，剔除同一病人同一部位分离的重复菌株，共发现203株对CRE亚胺培南或厄他培南耐药的菌株，所有菌株均采用用改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶检测验证。2016 年肠杆菌科分离的菌株数7 849 株，分离CRE菌46株，CRE菌检出率为0.59%（46/7 849）；2017 年肠杆菌科分离的菌株数9 011 株，分离CRE菌84株，CRE菌检出率为0.93%（84/9 011）；2018年1 至9 月肠杆菌科分离的菌株数5 473 株，分离CRE菌73 株，CRE 菌检出率为1.33%（73/5 473）。2016年1 月至2018 年9 月CRE 菌总体检出率为0.91%（203/22 333）。

2.2 CRE 菌株标本来源分布情况及构成比 203株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌标本来源不同临床科室，以痰液标本为主，占71.43%（145/203）；其次为中段尿液标本，占14.78%（30/203）；第三为分泌物标本，占5.42%（11/203），三者占总数的91.63%（186/203），见表2。

表2 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌标本来源分布情况及构成比

2.3 CRE 细菌临床科室分布情况 临床科室分布以儿科为主，占30.05%（61/203）；其次是重症监护室，共分离出44 株，占21.67%（44/203）；泌尿外科、血液科、急诊科和呼吸科分别占12.81%（26/203）、9.36%（19/203）、8.87%（18/203）和8.87%（18/203），其他科室共17株，占8.37%（17/203），具体见表3。

表3 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床科室分布情况及构成比

2.4 CRE 细菌种类分布情况 在203 株CRE 菌株中，以肺炎克雷伯菌为主，占57.14%（116/203），其次大肠埃希菌，占25.62%（52/203），第三为产气肠杆菌，占9.85%（20/203），具体见表4。

表4 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌种类分布及构成比

2.5 CRE 细菌药物敏感性 203 株耐CRE 细菌对18种常用抗菌药物的药敏结果中，CRE耐药率超过50.00%的抗菌药物有12 种，占总数的66.7%；对大部分β 内酰胺类药物呈现高度耐药，对亚胺培南的耐药率达到100.00%，对厄他培南的耐药率为82.27%；对头孢唑林耐药率为95.07%，对阿米卡星的敏感率最高，为77.34%；对第三代头孢菌素（头孢吡污，头孢曲松和头孢他啶）的普遍耐药率均在75.00%以上，对环丙沙星和庆大霉素的敏感性较好，敏感率均在60.00%以上。见表5。

2.6 CRE 细菌耐碳青霉烯酶基因检测 203 株CRE 菌株中NDM-1 基因扩增阳性的菌株有78 株，占38.42%，KPC 基因阳性共有49 株，占24.14%；其中NDM-1 和HPC 同时阳性者19 例，占9.36%；IMP基因阳性共有56株，占27.59%；OXA-48基因阳性共有20 株，占9.85%；未扩增出VIM 耐药基因。见表6。

表5 203株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对常用抗菌药物的药敏率

表6 203株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因检测阳性率

3 讨论

肠杆菌科细菌尤其是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，是常见社区获得性感染的病原菌。随着肠杆菌科细菌中多重耐药的急剧增多，由这些多重耐药菌引起的感染性疾病治疗的抗生素选择受到了限制，而这正威胁着公众的健康。

本研究结果显示，2016 年1 月至2018 年9 月从我院住院病人分离CRE 菌203 株，CRE 菌总体检出率为0.91%，高于东莞地区0.28%的CRE 检出率［7］，同时我院每年CRE 的检出率从呈现逐年递增的趋势，给临床治疗带来了极大的困难，应引起充分重视。CRE 菌主要来自痰液标本，占71.43%，大部分来源于重症监护室，这可能由于此类病人病情严重，多次进行各种侵入性操作如气管插管、插入呼吸机等，加上大量使用各类抗菌药物，甚至滥用，造成病人免疫力低下，造成人体正常菌群破坏，增加了耐药性CRE菌感染的机会。

CRE 细菌从科室分布来看主要来自儿科，占30.05%，这与周静芳等［8］报道的结果一致，一方面可能是因为儿科是我院特色科室，住院病人多，另一方面可能间接反映我院儿科用药不规范，应根据临床药敏结果合理用药。CRE 细菌来自11 个不同的临床科室，6种不同的临床标本，提示CRE细菌可引起多部位的感染。CRE 菌株中以肺炎克雷伯菌为主，占57.14%，与丁卉等［9］报道结果一致，提示临床分离出肺炎克雷伯菌时应根据药敏结果合理用药。

药敏结果分析发现，203 株CRE 菌对大多数抗菌药物耐药率较高，对头孢唑林耐药率为95.07%，在临床治疗时应避免选用该类药物。对阿米卡星的敏感率最高，为77.34%，可能是该类药物具有较强耳毒性和肾毒性，临床上该类药物使用较少，耐药发生少。鉴于其良好的敏感性，在安全情况下可优先考虑使用该类药物。对环丙沙星和庆大霉素的敏感性较好，敏感率均在60.0%以上。

碳青霉烯酶是一种能水解亚胺培南或美罗培南等抗菌药物的β-内酰胺酶，它包括A、B、D 三类酶，其中A 类为KPC 酶［10］，B 类为IMP 和VIM 金属酶［11］，D类为OXA-48型酶［12］。2009年，一种新型的金属β-内酰胺酶，被命名为新德里-β-内酰胺酶-1（NDM-1），从1 例印度裔瑞典男性尿路感染的病人尿液标本中分离的肺炎克雷伯菌检测出［13］。自从NDM-1的首次报道后，这一重要的碳青霉烯酶在多个国家的多种革兰阴性杆菌中检测出，代表了一新的挑战向感染性疾病的治疗［14-15］。研究表明，编码碳青霉烯酶的基因通常和其他耐药基因位于可移动的质粒上，这便利了多重耐药基因转移至其他细菌［16］。本研究中采用荧光定量PCR 技术对CRE 菌株耐药菌株基因型进行检测，比常规PCR和电泳相结合的方法更为方便，且结果容易判断，适合大规模样本检测。CRE 菌株NDM-1 基因阳性的菌株有78 株，占38.42%，KPC 基 因 阳 性 共 有49 株，占24.14%，提示我院CRE 菌以NDM-1 和KPC 基因型为主，今后的研究工作应对其同源性进行分析，判断有无院内传播流行。

综上，我院CRE 菌耐药较为严重，耐药基因以NDM-1 和KPC 为主，临床医生应加强耐药监测，合理选择抗菌药物，防止耐药株在院内传播流行。