CLIA值对应RPR滴度的ROC曲线分析及曲线拟合

滕 颖

天津市第二人民医院检验科 300192

梅毒是由苍白密螺旋体(Treponema pallidum，TP)苍白亚种引起的一种慢性系统性性传播疾病，可引起人体多系统多器官的损害，产生多种临床表现，导致组织破环，功能失常，甚至危及生命[1]。该疾病兼具有个人卫生和公共卫生的重要性，除了直接发病外，还会增加感染艾滋病毒的风险，并可能导致感染母亲所生的儿童终身发病。如果不进行治疗，疾病可以经过一系列临床阶段后最终导致不可逆的神经或心血管并发症[2]。WHO曾估计全球梅毒患病人数达到3 640万，其中发病的人数达到1 060万。

RPR技术现广泛用于梅毒诊断和疗效随访，其优点是价格低廉、操作简便，但RPR方法同时也存在一些缺点，如可由交叉反应导致假阳性，在早期或一期梅毒中可由于前带效应出现假阴性。最重要的是人为主观判定结果，操作者不同可引起结果判读的差异。尤其在患者的长期治疗过程中，极易由于操作人员前后不同导致结果判读标准不尽相同进而影响对疗效的判断。梅毒螺旋体化学发光免疫试验 (Chemiluminescence immunoassay，CLIA)客观性强且量化清晰，更适用于对梅毒的疗效观察。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年4月—2019年4月于本院就诊的梅毒患者375例，所有纳入者既往均经RPR、CLIA、ELISA及TPPA等检测确认为梅毒感染，收集这些患者的RPR结果和CLIA结果进行分析。

1.2 仪器与试剂 化学发光法采用美国雅培公司的ARCHITECT i2000SR全自动化学发光微粒子免疫分析仪，试剂为其配套Syphilis TP及相关校准品、质控品，快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)试剂盒为上海实业科华生物技术有限公司生产。

1.3 统计学方法 将RPR结果和CLIA结果进行spearman相关性分析以确定RPR与CLIA是否有相同的变化趋势。将CLIA检测值依据RPR滴度不同分组进行多组独立样本秩和检验。以化学发光法检测值为检验变量，以RPR滴度从阳性无滴度至1∶32的各种滴度为状态变量进行ROC曲线分析和约登指数计算得出各种RPR滴度对应的CLIA临界值。以RPR滴度为横坐标，以CLIA检测值为纵坐标绘制散点图并根据散点图拟合出CLIA最优曲线。所有数据采用SPSS25.0进行分析。

2 结果

2.1 经spearman相关分析RPR滴度与CLIA检测值正相关，相关系数r=0.756，P<0.01。

2.2 经Kruskal-Wallis分析，以RPR滴度分组，CLIA检测值在不同组间分布不完全相同(P<0.01)。

2.3 经ROC曲线分析及约登指数计算，将各RPR滴度对应的化学发光法对应临界值汇总如下(见图1～图6及表1)，各临界值具有统计学意义(P<0.05)。

图1 RPR阳性为治疗标准的ROC曲线图 图2 RPR 1∶2为治疗标准的ROC曲线图 图3 RPR 1∶4为治疗标准的ROC曲线图

图4 RPR 1∶8为治疗标准的ROC曲线图 图5 RPR 1∶16为治疗标准的ROC曲线图 图6 RPR 1∶32为治疗标准的ROC曲线图

表1 各RPR滴度对应的CLIA临界值

注：RPR滴度表示以大于及等于该滴度作为治疗标准。

2.4 曲线拟合选取R2最高的曲线为三次曲线，R2=0.695，F=281.805,P<0.01(见图7)。

图7 CLIA检测值与RPR的散点图及拟合曲线

3 讨论

梅毒作为一种传染性疾病，可累及多个器官，比如梅毒性心血管病，多在感染后10～25年开始出现心血管的临床症状和体征，诊断很困难。临床可有单纯性主动脉炎和继发性主动脉瓣关闭不全、冠脉口狭窄及主动脉瘤等不同类型表现。梅毒性主动脉炎是梅毒性心血管病最常见的表现[3]。张晓荣等证实即使RPR检查阴性，如果检查发现有升主动脉增宽、主动脉瓣关闭不全、主动脉窦部增宽及冠状动脉口狭窄的表现，提示可能潜在梅毒性损害[4]。梅毒眼部表现同样呈现多样化，超过1/3患者有持续的视力异常，患有乳头炎和视网膜炎可增加持续性视功能障碍的风险[5]。有学者指出早期神经梅毒在原发感染后几周到几年中出现并进展，并且主要涉及脑膜。综合征包括梅毒性脑膜炎(通常伴有颅神经病)，脑膜血管梅毒(伴有相关的缺血性中风)或无症状的神经梅毒。同时该学者还认为梅毒有助于HIV的传播(反之亦然)，因此所有被诊断为梅毒的患者都应接受HIV检测[6]。Novikov YA等认为在神经梅毒患者中，无论是否存在临床症状，脑脊液中IL-23和IL-12p40的水平均显著超过无神经系统特异性病变的患者[7]。梅毒还可引起胆管病变[8]、梅毒性肝炎[9]等。鉴于梅毒可引起多系统多器官的病变，中国疾病预防控制中心性病控制中心发布的梅毒感染诊疗指南中强调及早发现及治疗后要经过足够时间的追踪观察[10]。

RPR检验原理为梅毒螺旋体一旦感染人体，人体迅速对被损害的宿主细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放的类脂物质作出免疫应答，在3～4周产生抗类脂抗原的抗体(亦称为反应素)。这些抗体主要是IgG和IgM型混合抗体。RPR的优势在于价格低廉，操作简单，抗原悬浮液稳定，15min内可完成检测等。RPR的灵敏度取决于疾病阶段，为73%～100%，特异性达98%[11]。血清稀释按滴度判定，滴度越高，传染性越强。

CLIA法是利用双抗原夹心法化学发光免疫分析原理，采用梅毒螺旋体多种特异抗原包被固相发光微孔板，用辣根过氧化酶标记相同蛋白抗原作为标记抗原，与样本中的梅毒螺旋体抗体形成双抗原夹心复合物后，加入化学发光底物液，测定其发光值，根据阈值判定结果。CLIA操作自动化，敏感性根据疾病分期为82%～100%,特异性99%[11],敏感性和灵敏性均略胜于RPR。CLIA较RPR更利于检测流程标准化，结果判定客观性更强，更利于量化每个患者数据的纵向比较，对治疗效果的判读具有一致性，不受操作人员的影响，还可应用于大批量的检测。

本次纳入的样本为根据PRP滴度选取，每个滴度选取标本量相对较平均，现实标本为低滴度的标本多于高滴度的标本，这和疾病本身分布以及治疗后的血清固定有关。本次研究结果显示CLIA和RPR呈正相关趋势，两者的相关系数为0.756，说明RPR滴度越高CLIA检测值总体也越高，随着RPR滴度的增加，CLIA的检测值总体随RPR增加呈增高的趋势，同时两者相关性较强。秩和检验显示以RPR滴度分组比较CLIA检测值在不同组间分布不全相同，因此，将CLIA检测值作为RPR的替代具备一定可行性，但具体是否RPR和CLIA结果之间有一一对应的线性相关关系，进而可完全取代RPR滴度测定，还是只在某些区段呈线性相关则需要接下来的ROC曲线分析和拟合曲线等统计方法论证。

目前临床治疗梅毒主要有3种结果即临床治愈、血清固定和无效。主要采用RPR滴度作为指标，RPR阳性则给予青霉素等药物治疗，临床治愈指RPR转为阴性，并且两年内持续观察RPR为阴性；如规范抗梅毒治疗后RPR降低并维持在较低滴度不再下降且无其他症状则为血清固定，RPR滴度不变甚至增高则为无效，需要下1个疗程的治疗。

从本文的统计结果可以看出，RPR阳性对应的化学发光法临界值为13.655。即CLIA检测值高于13.655的患者可不再通过其他梅毒检测进行确诊，此前杨华等也曾报告以阳性预测值≥95%为目标，化学发光法筛查抗梅毒螺旋体抗体的复检范围S/Co比值设定为1.0～8.0，若S/Co比值≥8.1，可直接发出报告[12]。本文结果提示高于13.655表示需要给药治疗，或者已治疗者排除了血清固定的情况下尚需要进入下1个疗程，如果CLIA检测值长时间持续低于13.655，表示已临床治愈，不再需要抗生素治疗。本文的统计结果中对应于RPR滴度1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的CLIA法临界值依次为15.320、19.100、17.945、20.055和18.615。可以看出，虽然CLIA法临界值大体上呈随RPR滴度上升而上升的趋势，但在1∶8及1∶32两个滴度对应的CLIA趋势相反，虽然相反趋势的变化幅度并不大，但对应不同RPR滴度的CLIA检测值已有交叉，在未进行散点图及曲线拟合情况下分析这一结果可能有两个原因，一是RPR结果判定的主观性影响，即对于相邻结果的判定存在一定不确定性，这需要进一步加大纳入样本量甚至明确指定检验操作者来进一步分析这种结果的倒错是否为主观性影响；二是CLIA本身分布的类型问题，即CLIA检测值和RPR滴度两者间不是完全对应的线性相关。秩和检验后两两比较的结果也印证了这一点，并且这一推测在之后的曲线拟合中进一步得到了印证，从散点图即可看出RPR滴度和CLIA检测值之间并不是线性趋势，拟合出的最优曲线为三次多项式曲线，即CLIA的分布为先升高之后下降后再上升，这和之前ROC曲线的结果相互对应，即在RPR滴度低于1∶4之前RPR滴度和CLIA检测值之间变化趋势相同，高于1∶4之后两者趋势变化不尽相同，即以CLIA检测值分辨RPR滴度高于1∶4的样本时存在困难，目前临床上对于血清固定的认定基本不高于1∶8，但相对于更低滴度的血清固定来说，固定于1∶8的血清固定者较少，本文的CLIA法临界值虽然如前述在1∶8上有所反复，但在RPR阳性至1∶4这一阶段所对应的CLIA法S/Co值与RPR滴度正相关的趋势较好，即在临床应用中可满足大部分血清固定者的判定。更为保守一点的判读则可以将CLIA法S/Co值15.320以下，13.655以上的检测值作为血清固定的判定指标，此外，本文中RPR更高滴度(高于1∶32)的病例数据尚且较少，有可能CLIA值和RPR值的曲线关系比三次多项式曲线更为复杂，未来可进一步收集高滴度病例以完善高滴度RPR与CLIA检测值之间的对应关系。

综上所述，CLIA检测值与RPR滴度的对应关系为三次方曲线，CLIA检测值总体随RPR滴度增高有升高趋势，但在某些滴度有部分倒错。CLIA检测值高于13.655可不需要其他检测方法验证而直接作为梅毒患者确诊的指标，13.655也可作为给药和停药的指标，尚不能对RPR滴度始终高于1∶4的阳性患者的疗效进行判断，治疗后CLIA值介于13.655和15.320之间的病例可认定为血清固定，CLIA方法在判断滴度较低的血清固定病例有一定优势。以CLIA检测值完全取代RPR滴度作为疗效观察尚需更多的依据。