实体组织外泌体相关基因参与肝细胞癌病变的分析*

卢东军 杨武佳 潘沙沙 卢佳佳 阚 宠 黄小程 阮文慧 唐玉莲 倪安妮 李根亮

右江民族医学院，广西百色市 533000

中国肝癌年发病率为20～40/10万，肝癌患者总数占全球的一半。肝癌患者死亡率居于恶性肿瘤第2位，严重危害人体健康，每年有30余万中国人死于肝癌[1]。外泌体(exosome)是一种通过细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级细胞外膜泡，可以在血清、乳汁、尿液等多种体液中检出[2]。卵巢、乳腺、前列腺、结直肠等许多器官的癌变组织和细胞都能分泌外泌体，且癌细胞对外释放的外泌体量远高于正常细胞[3-4]。外泌体在细胞间起提呈、传递物质信息等作用，在细胞的生理、病理过程中扮演着重要角色。此外，外泌体还参与了肿瘤局部微环境的构成及生理调控，影响着肿瘤的生长及发展[5]。肝癌微环境中的外泌体可通过表面膜分子成分作用于临近细胞或远端靶向细胞，并通过受体配体及胞吞作用调控靶细胞的功能，从而参与癌症的发生[6]。近年来，越来越多的人研究了体液外泌体参与癌症发生的途径，一些外泌体蛋白质标志物已被用于癌症的早期诊断和预后复发风险的评估[7]。但实体组织外泌体的研究，则由于提取方法的烦琐而研究者相对较少，尤其是实体组织外泌体参与癌症发生的机制还有待进一步研究。

本研究以肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)模型小鼠的瘤体组织和癌旁组织为实验材料，通过RNA-seq和生物信息学等手段，分析比较两类样本中外泌体相关组分的分布及其在HCC中的可能功能，探讨实体组织外泌体在HCC发生中的可能作用，研究结果对理解实体组织外泌体参与HCC发生机制具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 外泌体相关差异表达基因筛选 以“exosome、tissue和Mus musculus”为关键词，在NCBI数据库中检索，检索结果与本实验室前期测序数据中的差异表达基因进行比较，筛选出在瘤体组织和癌旁组织两类样本中差异表达泌体相关基因。

1.2 外泌体相关差异表达基因的功能分析 利用DAVID 6.8在线软件对实体组织外泌体相关差异表达基因进行功能富集分析。

1.3 外泌体相关差异表达基因编码蛋白的互作分析 通过STRING 11.0版本在线对实体组织外泌体相关差异表达基因编码蛋白进行互作分析，以评价基因功能上的相关性。

1.4 外泌体相关差异表达基因的RT-qPCR 随机选择4个实体组织外泌体相关差异表达基因，参照本实验室之前的RT-qPCR反应条件及计算方法分析基因在样本中的相对表达量[8]。引物采用Primer-Blast软件设计，并由上海生工有限公司合成。

2 结果

2.1 外泌体相关差异表达基因的筛选和功能分析结果 通过比对分析，我们共筛选出20个实体组织外泌体相关差异表达基因，即Car4、PFKL、CD63、FN1、DBI、DUT、wisp2、ADAM15、LAP3、SERPINA5、LGALS3、GPRC5C、ECH1、EXOSC9、FAS、IL6RA、TNFRSF1B、HGF、TNFRSF10B、LMO7。这些基因共被富集到1个BP(生物学过程)、5个CC(细胞组分)、2个MF(分子活性)和1个KEGG信号通路(见图1)。从5个CC可以看出，大量实体组织外泌体相关差异表达基因分布于细胞表面、细胞外空间、细胞外区域、顶质膜等部位。富集到的BP为细胞粘连，MF为整联蛋白结合和蛋白酶结合，信号通路则为癌症中的蛋白聚糖，且有18个基因，即Car4、PFKL、CD63、FN1、DBI、DUT、WISP2、ADAM15、LAP3、SERPINA5、LGALS3、GPRC5C、ECH1、EXOSC9、FAS、IL6RA、TNFRSF1B、HGF具有糖基化位点。另外，功能富集结果显示，一些实体组织外泌体相关差异表达基因还参与其他多种生理功能，如LGALS3、FN1和WISP2等参与胞外基质的构成，CD63和FN1参与细胞—基质粘连过程；FAS和TNFRSF1B具有肿瘤坏死因子激活受体活性且参与非固有凋亡信号通路；LGALS3和HGF具有趋化黏附活性，并与FN1和FAS等一起参与细胞凋亡程序的负调控。

2.2 外泌体相关差异表达基因编码蛋白的互作结果 实体组织外泌体相关差异表达基因编码蛋白的互作关系见图2。

2.3 外泌体相关差异表达基因的RT-qPCR和RNA-seq的结果比较 RT-qPCR与RNA-seq的数据比较显示，两种方法所得结果一致。相关差异表达基因的RT-qPCR引物及在HCC中的表达情况分别见表1和图3。

图1 肝癌微环境中实体组织外泌体相关差异表达基因的生物学功能

图2 肝癌微环境中实体组织外泌体相关差异表达基因编码蛋白的互作关系

表1 基因RT-qPCR引物

图3 实体组织外泌体相关差异表达基因RT-qPCR与 RNA-seq分析

X轴表示不同的差异表达基因，Y轴表示差异表达基因表达的相对比率的基数10对数

3 讨论

本研究通过从NCBI数据库中检索实体组织外泌体相关基因，与测序数据比较，筛选出实体组织外泌体相关差异表达基因。通过功能富集发现，这些差异表达基因主要存在于细胞表面和细胞外区域，参与的生物学过程主要是细胞粘连，且这个过程与癌症中的蛋白多糖信号通路相关。有研究报道，蛋白多糖可以调节细胞粘附和运动，影响细胞内的膜运输[9]。此外，我们的富集结果还显示，这些基因涉及的分子活性主要是整联蛋白结合和蛋白酶结合。整联蛋白作为跨膜接头在细胞外基质和细胞内肌动蛋白骨架之间起双向联络作用，可将细胞外基质同细胞内的骨架网络连成一个整体，起细胞粘着作用。我们富集到的信号通路是癌症中的蛋白聚糖。蛋白聚糖是细胞外基质的主要成分，肝脏的病变会导致蛋白多糖的过度合成,在实体瘤和造血系统恶性肿瘤的发展过程中影响癌细胞的行为及其微环境[10]。外泌体生物发生的过程允许包装来自膜和胞质来源的分子[11]。

在肝癌微环境中，外泌体可被其他细胞摄入和内化，并传递具有一定功能的基因，协助肿瘤细胞与基质细胞间进行信息传递及物质交换,促进肿瘤的增殖及远端转移[12]。我们的研究发现，实体组织外泌体相关差异表达基因在参与肝癌发生的过程中，还可能涉及胞外基质的构成、细胞—基质粘连、肿瘤坏死因子激活受体参与人非固有凋亡信号通路、趋化黏附及细胞凋亡程序的负调控等生物学功能。近年来,也有研究报道外泌体可作为新的信号传递载体，携带蛋白质、DNA、RNA、miRNA和脂类等物质,介导细胞与细胞之间、组织与组织之间的相互作用[13]。而且肿瘤细胞分泌的外泌体，还可以改变靶组织的微环境，介导肿瘤细胞的迁移,进一步实现癌症的转移[14]。人类肝癌细胞分泌的含有多种miRNA的外泌体可减弱其他肝癌细胞中转化生长因子β的信号途径中相关蛋白质的表达,显著促进肝癌细胞的生长[15]。

综上所述，在肝癌微环境中，实体组织外泌体相关基因存在于细胞表面、细胞外空间、细胞外区域和顶质膜上，通过细胞粘连以及癌症中的蛋白多糖为信号通路，发挥整联蛋白结合、蛋白酶结合的分子活性，参与了肝癌微环境的形成和发展。据此我们推测，随着研究的不断深入，运用实体组织外泌体对肝细胞癌进行诊断将有助于对肝癌的防治。