基于网络药理学探讨莪术抗血栓作用机制

周曙光，韦 洁，廖 欣，庞力峰，杨希霖

（1.广西壮族自治区人民医院，广西 南宁 530022；2.广西中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022）

莪术是姜科植物蓬莪术、广西莪术或温郁金的干燥根茎，性辛、温，味苦，归肝、脾经，具有行气破血、消积止痛的功效，临床上多用于治疗血滞经闭腹痛。近几年，多项药理研究指出莪术活性成分具有抗炎、抗肿瘤等作用［1-3］；课题组前期发现，莪术不同溶剂提取部位均具有抗血栓作用［4-5］，但具体机制仍未知，本研究将从网络药理学角度探究其抗血栓的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 莪术化学成分筛选 本研究利用中药系统药理学平台（TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）检索莪术的所有化学成分，共搜集了81 个化合物。鉴于莪术油活性成分具有明确的抗血栓作用［6］，为充分考虑莪术药物特性和优势，避免药效成分信息遗漏，本研究设置口服生物利用度（OB≥25%）和类药性（DL≥0.06）为筛选阈值，获得34 个化合物作为莪术活性成分。

1.2 莪术活性成分候选靶点筛选 利用TCMSP 和BATMANTCM 平台，对34 个化合物的潜在靶标进行预测，其中TCMSP平台优选Drug Bank 已验证靶点，BATMAN-TCM 平台优选Score≥40 的靶点，采用药物相似性比对原理，将所收集靶点汇总去冗余，即为药物预测靶点。

1.3 血栓疾病基因收集 利用 DrugBank、OMIM、DisGeNET 数据库获取血栓相关的疾病基因，将所收集基因靶点去冗余，即为血栓靶点。

1.4 药物活性成分-靶点网络的构建与分析 将莪术活性成分-靶点网络文件导入Cytoscape3.5.1 软件，通过Network Analyzer 工具分析网络节点，获取对应拓扑度值（degree），以≥2 倍degree 的中位数为筛选条件，获取莪术活性成分作用的潜在关键靶点。

1.5 药物活性成分-靶点-疾病相互作用网络的构建与分析 获得莪术成分对应靶点和疾病靶点信息后，利用String软件构建药物靶点-疾病的蛋白互作网络（PPI），再利用Cytoscape3.5.1 软件构建药物活性成分-靶点-疾病网络，提取网络中的交集部分，即为莪术抗血栓关键靶点。

1.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 数据库工具和Cytoscape ClueGo 插件分别对上述关键靶点／基因进行KEGG 通路富集分析和GO 分析，获得莪术治疗血栓相关疾病的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

2 结果

2.1 莪术的活性化学成分 通过OB≥25%和DL≥0.06 筛选获得34 个化合物，见表1。

2.2 莪术活性化学成分-靶点网络构建 从TCMSP 数据库（Drug Bank 已验证靶点）和BATMAN-TCM 数据库（Score≥40）中，获取上述34 个化合物的预测靶点。其中有5 个成分，姜黄酮、Wenjine、三环萜、（4S，5S）-（+）-吉马酮4，5-环氧化物、双去甲氧基姜黄素，无符合筛选条件的对应靶点，故舍弃。利用Cytoscape 3.5.1 构建莪术活性成分-靶点网络，如图1 所示，莪术29 个主要活性成分的靶点（去冗余）共计81 个。在该成分-靶点网络中，靶点网络节点的degree 中位数为3，选取degree≥6 的节点作为莪术活性成分的关键作用靶点，共计17 个，在图中为成分靶点集合内圈。该17 个作用靶点分别与27 个药物活性成分发生相互作用，如表2 所示。

2.3 药物成分-靶点-疾病网络构建 Drug Bank、OMIM 和DisGeNET 数据库中以“Thrombosis”为关键词搜索血栓相关疾病及靶点，获得61 个疾病基因。将活性成分靶点-血栓靶点网络文件导入Cytoscape 3.5.1，构建莪术活性成分靶点-血栓靶点网络（图2），提取靶点交集部分靶点共20个（表3），作为莪术活性成分抗血栓关键靶点，并制作蛋白互作（PPI）网络（图3）和活性成分-血栓靶点网络（图4），网络的拓扑结构参数如表4 所示。

表1 莪术主要活性化学成分

图1 莪术活性成分-靶点网络

2.4 莪术抗血栓关键靶点的KEGG 分析和GO 分析 取上述关键靶点，利用DAVID 数据库进行KEGG 分析。KEGG富集结果显示，符合P＜0.05 的富集信号主要涉及凝血反应（Complement and coagulation cascades，Platelet activation）、神经活性配体受体反应（Neuroactive ligand-receptor interaction）、肾素分泌（Renin secretion）、脂肪细胞脂肪分解（Regulation of lipolysis in adipocytes）等，见表5。

表2 关键靶点及对应的药物成分

图2 药物活性成分靶点-血栓靶点网络

表3 莪术抗血栓关键靶点

利用Clue GO 插件，将莪术抗血栓关键靶点导入Cytoscape 3.5.1，筛选P≤0.05 的富集信号，获取莪术抗血栓机制的生物学过程（Biological Process，BP）相关条目共计30 项，涉及cGMP 信号、凝血通路、蛋白激活通路、腺苷受体信号通路、血小板相关受体信号通路等，见图5～6。

图4 莪术活性成分-血栓靶点网络

表4 莪术抗血栓关键靶点拓扑参数

表5 莪术抗血栓关键靶点KEGG 富集信号通路

图5 莪术抗血栓关键靶点的GO 富集分析结果

图6 莪术抗血栓关键靶点的生物学功能注释

3 讨论

中药由于成分多样而出现“一药多效”，近几年来网络药理学的快速发展为其作用机制研究提供了新手段。它能够将药物作用网络与生物网络整合在一起，通过网络特征分析快速高效地筛选中药有效成分，分析成分之间可能的相互作用，并探讨药物成分的潜在作用靶点及发挥的生物学效应，简化了药效物质基础及作用机制的发现过程［7-8］。

课题组前期研究表明，莪术不同溶剂提取物具有抗血栓效果，然而具体作用机制不明。本研究通过网络药理学预测，莪术中有29 种活性成分，莪术二酮、β-榄香烯、吉马酮、姜黄酮等，可能通过作用于凝血通路（靶点为F2、F3、F9、F7、F10、FGA、PROC、PROS1、TFPI）、血小板聚集通路（靶点为FGA、PTGIR、PTGS1）干预凝血级联反应和血小板激活聚集过程，从而发挥抗血栓作用。

F10（凝血因子X）和F2（凝血因子II）是外内源性凝血反应的核心酶，介导凝血酶原的转化和凝血酶的形成，联合上游F3（凝血因子III）、F7（凝血因子VII）和F9（凝血因子IX）等内外源性凝血关键因子，对最终的凝血过程和血栓形成具有决定性影响［9］。FGA 是由肝脏合成的纤维蛋白前体，能在内源凝血因子或外源组织因子作用下生成纤维蛋白，参与机体凝血过程［10］。蛋白C（PROC）和蛋白S（PROS1）是机体蛋白C 抗凝系统的重要组成部分，其中PROC 在血浆中为无活性的酶原形式，可被凝血酶活化为APC，PROS1 可协同APC 水解灭活部分活化的凝血因子（FVa、FVIIIa），减缓内源性凝血速度［11］。

多项研究［5，12］表明，莪术可通过影响花生四烯酸代谢产物的生成，如6-keto-PGF1α（PGI2 代谢产物）和TXB2（TXA2 代谢产物），进而发挥抗血栓作用。本研究所预测的关键靶点和信号通路，血小板激活通路（platelet activation）及其关键靶点（FGA、PTGIR、PTGS1）与上述抗血栓机制关联性较大，共有6 种化合物参与了该通路，且目前并未发现莪术相关物质对这几个相关靶点的研究报道。其中上述靶点分别编码纤维蛋白原（Fg）、前列环素PGI2受体（IP）和环氧合酶1（COX1）3 种蛋白，IP 和COX1参与花生四烯酸代谢，影响花生四烯酸及代谢产物诱导的血小板聚集和血栓形成［13］。

此外，经过活性筛选的莪术成分，共有5 种化合物可能与F2（凝血因子II）产生相互作用，鉴于F2 在凝血途径中处于下游关键环节，同时也参与了血小板活化过程，F2 也是莪术多成分发挥抗血栓作用的关键靶点。

莪术二酮、β-榄香烯、吉马酮等属于莪术油活性成分，姜黄酮属于姜黄素类成分，莪术油成分和姜黄素类成分的抗血栓作用在多项研究中也得到了证实，更佐证了该网络药理学预测方法的可行性［14-15］。