复方七芍降压片对SHR 大鼠IL-8、IL-10 水平及AP-1、MCP-1 蛋白表达的影响

任卫琼李 弘刘叶倩龚 姗刘 林王宇红∗

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

近10 年，我国成年人中约有30%患有高血压，其中一部分伴随着冠状动脉疾病、中风和心力衰竭等的发生［1-2］，高血压是导致人类死亡的重大疾病之一，我国患者以原发性高血压为主，其发生、发展机制复杂，是在炎症、神经-免疫因素等多种因素的相互作用下导致的［3］。近年来，炎症与高血压的相关性已成为研究的热点，国内外文献均报道炎症与高血压的发生、发展及转归密切相关［4］，文献［5-6］报道通过调控激活子蛋白-1（AP-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），会影响炎症因子的释放。课题组前期研究发现，复方七芍降压片对高血压患者具有较好的治疗作用，其机制与改善炎症有关，但该方是否通过AP-1、MCP-1 通路影响炎症因子的释放发挥调控血压的作用尚不明确。因此，本实验采用复方七芍降压片干预自发性高血压大鼠（SHR），观察其对SHR 的降压作用及对炎症因子白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）水平和AP-1、MCP-1 蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF 级、6～7 周龄雄性SHR 大鼠30 只，体质量130～150 g；6～7 周龄雄性WKY 大鼠10 只，体质量130～150 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号11400700359571，动物生产许可证号SCXK（京）2016-006，实验动物环境设施合格证号SYXK（湘）2015-0003。

1.2 试剂与药物 复方七芍降压片（0.46 g／片，批号20181026），人临床用量为12 片，相当于含生药量97 g，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科制备；厄贝沙坦片（75 mg／片，批号17122111），人临床用量为300 mg／d，购自扬子江药业集团北京海燕药业有限公司；IL-8、IL-10 检测试剂盒（批号20190305，上海晶天生物科技有限公司）；c-jun（批号AI03113818）、MCP-1（批号AB05105689）一抗购自美国Bioss 公司。

1.3 仪器 AUW2200 型分析天平（日本岛津公司）；BP2010 型无创血压检测仪（北京软隆科技有限公司）；H1850 型低速台式离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；BMJ-1n 型病理组织包埋机、包埋冷冻台（上海珂淮仪器有限公司）；TS-12F 型生物组织自动脱水机（上海华岩仪器设备有限公司）；UC-7 超薄切片机（北京冠普佳科技有限公司）；日立HT7700 透射电镜（上海天美科学仪器有限公司）；OLYMPU 倒置显微镜和照相装置（日本Olympus 公司）；KS400 型图像分析仪（德国Zisse 公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 30 只SHR 大鼠根据体质量、血压，随机分为模型组、厄贝沙坦片组、复方七芍降压片组，每组10 只；另设10 只WKY 大鼠为正常对照组。正常对照组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水，厄贝沙坦片组大鼠给予厄贝沙坦片混悬液（27 mg／kg），复方七芍降压片组大鼠给予复方七芍降压片药液［8.73 g／kg（生药）］，给药体积为10 mL／kg，灌胃给药1 次／d，连续给药6 周，每周测量1次血压和体质量。

2.2 血压测定 分别在给药前及给药第1、2、3、4、5、6周早上8：00～12：00，采用无创血压仪测量大鼠给药后1 h尾动脉压，每只测量3 次，取平均值。

2.3 透射电镜观察肠系膜动脉超微结构 取肠系膜上动脉（二级分支）于2.5%戊二醛中固定，4 ℃过夜，1%锇酸固定液固定1～2 h，丙酮梯度脱水、浸泡、包埋，37 ℃烘烤过夜固定，切超薄片（50～100 nm），3% 醋酸铀、硝酸铅双染色，透射电镜下观察并拍照。

2.4 ELISA 法检测血清中IL-8、IL-10 水平 在末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后采取腹主动脉血于血清管中（不抗凝），静置2 h，离心（4 500 r／min）10 min，取上清于1.5 mL 离心管中，贮存于-80 ℃冰箱。严格按照试剂盒说明书的操作步骤，测定血清中IL-8、IL-10水平。

2.5 免疫组化检测AP-1、MCP-1 蛋白表达 取肠系膜上动脉（二级分支），生理盐水清洗干净，4%多聚甲醛固定，浸蜡包埋，切厚度为5 μm 的切片，二甲苯脱蜡，酒精逐级脱水，一抗孵育4 ℃过夜，二抗孵育，DAB 显色，复染，脱水封片。光镜显微镜下，观察肠系膜动脉中AP-1、MCP-1 的蛋白表达。

2.6 统计学分析 应用SPSS19.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者采用方差分析，两两比较采用LSD 检验；方差不齐者采用秩和检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 复方七芍降压片对SHR 大鼠体质量的影响 给药前，各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠体质量在前4 周上升较快，之后增加有所减慢，可能与年龄增长有关，提示药物治疗6 周对大鼠体质量影响较小。见图1。

3.2 复方七芍降压片对SHR 大鼠收缩压的影响 给药前，与正常对照组比较，模型组、厄贝沙坦片组、复方七芍降压片组大鼠收缩压更高（P＜0.01）。药物治疗后，与正常对照组比较，模型组大鼠各周收缩压均上升（P＜0.01）；与模型组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠各周收缩压均下降（P＜0.01），以厄贝沙坦片组降压效果更优。见图2。

图2 复方七芍降压片对SHR 大鼠收缩压的影响

3.3 复方七芍降压片对SHR 大鼠肠系膜动脉超微结构的影响 正常对照组大鼠动脉血管内皮细胞扁平，排列整齐、紧密，体积较小，偶见散落的内皮细胞，核正常；平滑肌细胞形状规则，均匀分布，细胞核完整，核膜光滑，染色质分布均匀；细胞外基质较少，无明显的胶原纤维。与正常对照组比较，模型组大鼠动脉血管内皮细胞与动脉内膜脱离，体积增大，细胞核水肿，呈高柱状突入血管管腔；平滑肌细胞增多，呈不规则形状，体积显著增大，排列不规则，细胞核固缩凋亡；细胞外基质及胶原纤维明显增多。治疗6 周后，与模型组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠动脉得到显著改善，内皮细胞体积明显缩小，与动脉内膜连接较为紧密，细胞核显著减小，未见呈高柱状突入血管管腔的内皮细胞；平滑肌细胞分布均匀，体积未见明显增大，形状较为规则，细胞核略有皱缩；细胞外基质及胶原纤维增多不明显。见图3。

3.4 复方七芍降压片对肠系膜动脉中AP-1、MCP-1 蛋白表达影响 正常对照组大鼠动脉中阳性染色较弱；模型组大鼠动脉阳性染色较强，内膜部分脱落，中膜平滑肌细胞迁移、排列不规则；厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠动脉阳性染色较弱，中膜平滑肌细胞未见明显增殖，排列整齐，内膜损伤得到改善。阳性染色多见细胞质和细胞核中。与正常对照组比较，模型组大鼠动脉中AP-1、MCP-1蛋白表达均增加（P＜0.01）；与模型组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组大鼠动脉中AP-1、MCP-1 蛋白表达均降低（P＜0.05）。见图4～5。

3.5 复方七芍降压片对SHR 大鼠血清中IL-8、IL-10 水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清中的IL-8 水平升高，IL-10 水平下降（P＜0.01）；与模型组比较，厄贝沙坦片组和复方七芍降压片组血清中IL-8 均降低，IL-10水平均升高（P＜0.05）。见图6。

4 讨论

图3 各组大鼠肠系膜动脉壁超微结构（5 μm）

图4 各组大鼠肠系膜动脉AP-1、MCP-1 蛋白表达（免疫组化，×400）

图5 各组大鼠肠系膜动脉AP-1、MCP-1 平均光密度

图6 各组大鼠血清中IL-8、IL-10 水平

高血压是常见的心血管疾病之一，在全球具有较高的发病率和致死率［7］。炎症因子（IL-1、IL-8、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子-α 等）可以损伤血管内层的内皮细胞及中层的血管平滑肌细胞，引起血管壁的病理变化（如管腔狭窄等），造成血管阻力升高，在高血压的发生、发展过程中发挥着重要的作用［8］。因此，保护血管内皮细胞和平滑肌细胞的正常功能，对于保护血管，防治高血压极其重要。本研究在电镜下观察到，模型组大鼠肠系膜动脉内皮细胞脱落、水肿，平滑肌细胞增殖、核凋亡，推测在高血压状态下，血管壁发生病理变化，造成血管阻力升高，升高血压；与模型组比较，复方七芍降压片组内皮细胞体积缩小，与内膜连接紧密，平滑肌细胞分布均匀，体积较正常。

IL-8、IL-10 均为白细胞介素家族中的一员，与高血压密切相关，但IL-8 是一种促炎因子，其对高血压的病情起着促进的作用，其可损伤内皮细胞，与高血压病情程度呈正相关［9］；IL-10 是一种抗炎因子，其可以抑制IL-1、IL-8、TNF-α 等促炎因子的产生，减轻炎症损伤，并可以改善内皮功能，抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移，进而降低血压，改善血管重塑［10-11］。有研究发现，抵当汤可以通过降低高血压急性期患者血清中IL-8 水平，升高IL-10 水平，来减轻炎症反应，降低血压［12］。本研究发现，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中炎症因子IL-8 水平增高、IL-10水平降低，血压升高，推测在高血压病理条件下，炎症水平升高，损伤血管，促进高血压发展；与模型组比较，复方七芍降压片组大鼠血清中炎症因子IL-8 水平降低、IL-10水平升高，血压降低。

AP-1 是存在于真核细胞中的转录激活因子，主要由原癌基因编码的蛋白质Jun 和Fos 组成。在血管内皮细胞、平滑肌细胞等不同的细胞中，AP-1 的激活够能诱导多种炎症因子的释放，引起血管内皮细胞、平滑肌细胞及炎症细胞的增殖和迁移，导致管腔狭窄，引发病理性血管重塑［13］。研究发现，黄芩素、栀子苷均可以通过抑制AP-1的转录活性，抑制炎症因子（如IL-6、TNF-α、NO 等）的表达，发挥抗炎的作用［14-15］；在肠系膜动脉中发现，AngⅡ可以刺激平滑肌细胞中c-fos mRNA 表达，介导平滑肌细胞在高血压中的增殖及迁移作用［16］；MCP-1 是最关键的趋化因子之一，能够诱导单核／巨噬细胞浸润至受损的血管壁，促进VSMC 增殖和迁移，引发血管局部炎症反应，损伤血管；在RNAI 干扰技术沉默MCP-1 表达的小胶质细胞中，TNF-α，IL-1β 和IL-6 的表达降低，减弱了神经元损伤［17］。据研究显示，小鼠MCP-1 基因启动子区的调控序列主要存在于-2600～-1 bp，包括NF-κB、AP-1 等多种转录因子的结合位点；血管内皮细胞能够增强AP-1 与MCP-1基因启动区结合活性，诱导其产生MCP-1［18-19］。本研究发现，与正常对照组比较，模型组大鼠肠系膜动脉中AP-1、MCP-1 的蛋白表达增加，推测在高血压状态下，激活了AP-1 及其与MCP-1 的结合活性，诱导了炎症反应，损伤了血管。与模型组大鼠比较，复方七芍降压片组大鼠肠系膜动脉中AP-1、MCP-1 的蛋白表达降低。

在动脉粥样硬化和心肌炎相关实验中发现，脂肪分化相关蛋白、IL-17 分别可以诱导巨噬细胞、心肌细胞中AP-1、MCP-1 蛋白高表达，促进炎症水平，给予AP-1 抑制剂后，MCP-1 蛋白表达、炎症水平降低［5-6］。复方七芍降压片降低血压的机制可能为通过抑制肠系膜动脉中AP-1 活化，在转录水平抑制MCP-1 的蛋白表达，降低炎症因子水平。今后将运用AP-1、MCP-1 受体沉默技术干预SHR 大鼠，探究在2 种受体沉默时它对SHR 大鼠血压及炎症因子的影响。