姜黄素联合5-氟尿嘧啶对结肠癌SW620 细胞体外抑制的影响

张闰哲徐 露姚庆华∗

（1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.中国科学院大学附属肿瘤医院中西医结合科，浙江省中西医结合肿瘤重点实验室，浙江 杭州 310022）

结肠癌是指结肠黏膜上皮或腺体在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一。结肠癌是全世界第三大常见癌症，全球新病例接近120 万，死亡病例发生约60.8 万，占所有癌症死亡人数的8%，是造成癌症死亡的第四大常见原因［1］。

目前，化疗是结肠癌患者治疗有效的手段，5-FU 类药物是治疗进展期最主要的药物，然而其化疗耐药是导致患者化疗失败的重要原因，在进展期治疗中只有10%～15%的效果［2］。因其机制复杂，目前尚未得到有效解决。

随着近年中草药的发展，天然植物或者矿物中药提取的单体有效成分已经成为全球研究的热点［3］。中药成分姜黄素是中药姜黄提取的多酚类化合物，具有抗氧化、抗耐药、抗炎、抗病毒和抗凝作用，尤其它的抗肿瘤作用可以增加化疗药物敏感性，且有普遍研究意义［4-8］。本研究旨在探究姜黄素联合5-FU 应用于结肠癌SW620 细胞，观察姜黄素与5-FU 联合用药对SW620 细胞生长抑制是否具有协同作用，并初步阐明其机制。

1 材料

1.1 试剂与药物 姜黄素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号C140600，纯度≥65%）；5-FU（美国Selleck 公司，货号s1209，纯度99.97%）；四甲基偶氮哇蓝（MTT，美国Sigma 公司，货号3580GR001）；DMSO（美国Sigma公司，批号67-68-5）；1640 培养基（美国Gibico 公司，批号8118241）；DMEM 培养基（批号2017062901）、胰蛋白酶消化液（批号2017062802）购于杭州吉诺生物医药技术有限公司；Annexin V-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，货号556547）；Cleaved-Caspase Ab Sampler Kit（美国 CST 公司，批号 8072965）；GAPDH（货 号sc-32233）、HRP 标记羊抗鼠二抗（货号SA00001-1-A）和兔二抗（货号SA00001-2）购自美国Proteintech 公司。

1.2 仪器 电热恒温水浴箱（型号AODHG-HH-W600）购于山东济南赫威科技有限公司；BIOBASE 博科二氧化碳细胞培养箱（型号QP-80）、BIOBASE 博科酶标仪（型号EL-10 A）均购于山东济南飞捷医疗设备有限公司；台式高速低温离心机（型号TGL-20M）购于山东济南赫威科技有限公司；光学显微镜（型号LB-270）购于北京世联博研科技有限公司；流式细胞仪（型号BD-Accuri-C6）购于北京科誉兴业科技有限公司；伯乐蛋白电泳仪（型号C1000）购于美国Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 药物溶液制备 称取一定量的姜黄素粉剂，DMSO 溶解，配成100 mmol／L 贮备液，-20 ℃保存，使用前用培养液稀释成所需的浓度，并使所含DMSO 小于0.1%。据文献记载，进口DMSO 浓度在0.1% 以下对细胞抑制增殖无影响［9-10］，故本实验忽略0.1% DMSO 影响，仅设立空白对照组及姜黄素组。

2.2 细胞培养 结肠癌SW620、HCT-8、LOVO、HCT-116、SW480 细胞株均购自浙江省肿瘤研究所。结肠癌细胞株在含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，0.25% 胰蛋白酶消化3 min，以1∶2～1∶4 比例传代。

2.3 MTT 法检测细胞增殖抑制作用 取对数生长期细胞，以3 000／孔接种于96 孔板中，培养24 h；姜黄素组加入姜黄素（1、2、4、8、16、32 μmol／L），5-FU 组加入5-FU（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 μmol／L），对照组予以含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培养基；各组继续培养24、48 h，加入MTT 孵育4 h，加入DMSO，全自动酶标仪测定OD（570 nm），计算细胞增殖抑制率｛ ［（OD对照组-OD给药组）／OD对照组］×100%｝。

2.4 姜黄素联合5-FU 协同作用SW620 细胞的检测 取对数生长细胞，以3 000／孔接种于96 孔板中，预处理姜黄素联合5-FU：细胞培养24 h，加入姜黄素预处理24 h，吸出旧培养基，加入5-FU 继续干预48 h，MTT 检测。姜黄素同时联合5-FU：细胞培养24 h，吸出旧培养基，加入姜黄素和5-FU 共同干预48 h，MTT 检测。

Chou-Talalay 又称中位药效法（median-drug effect analysis）、联合指数法（combination index method），是用于研究药物协同作用的定量分析。2005 年Martin 等［11］对Chou-Talalay 的数学模型开发了第3 代药物联合作用量-效分析软件“CompuSyn”，且成为当代抗肿瘤药物联合作用研究的最普遍方法之一。Chou-Talalay 根据Median-effect方程（药物自身药动学及药物之间药效学联系）衍生出新的数学模型［12］，关于该模型细节操作详见参考文献［11-14］。

联合指数（combination index，CI）不仅描述药物拮抗作用、相加作用及协同作用，同时对定量-效应水平下的效应进行定性描述。Median-effect 方程曾导出两药联合CI公式为CI＝（D）1／（DX）1+（D）2／（DX）2，D为单用剂量，DX 为联合剂量，具体推导公式见参考文献［12］。如今，在确定药物数量、有无拮抗作用和剂量选择条件下，先根据MTT 获得的量-效关系进行等效量和等量效比较，最后应用“CompuSyn”（基于Chou-Talalay 模型应用），软件输入计算CI，从而分析药物间联合效应，即CI＞1为拮抗作用，CI＝1 为相加作用，CI＜1 为协同作用。

2.5 流式细胞仪检测SW620 细胞的凋亡率 培养对数生长期细胞，制成细胞悬液（1×105／mL），以2 mL／孔接种于6 孔培养板中，并置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，弃去旧培养液，加入含不同浓度姜黄素的培养基1 mL，预处理24 h 后，弃培养基并分别加入相应浓度的氟尿嘧啶培养48 h，收集细胞，500×g离心5 min、PBS洗涤，加入染色缓冲液悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，混匀后再加入PI 染料10 μL，避光室温反应20 min。最后将细胞放入流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算细胞凋亡率。

2.6 Western blot 检测凋亡相关蛋白表达 按照“2.5”项下条件培养细胞。收集细胞，RIPA 裂解液提取蛋白。在预制凝胶板中上样，电泳100 V、1 h 转膜200 mA、2 h，封闭1 h，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育2 h，最后进行图像采集和分析。

2.7 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 姜黄素与5-FU 对结肠癌细胞株增殖的抑制作用 MTT结果显示，5-FU 处理SW620 细胞48 h，IC50为（367.20±16.80）μmol／L，其对SW620 细胞抑制作用较弱（表1～2）；姜黄素（1～32 μmol／L）处理SW620 细胞24、48 h，能抑制SW620 细胞增殖（P＜0.01）（表3）。48 h 药物暴露处理所得的实验结果最佳，选择SW620 细胞开展姜黄素对5-FU 增敏作用的研究。

表1 5-FU 处理48 h 后对结肠癌细胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表1 5-FU 处理48 h 后对结肠癌细胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表2 5-FU 对SW620 细胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表2 5-FU 对SW620 细胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01。

表3 姜黄素对SW620 细胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表3 姜黄素对SW620 细胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01。

根据CompuSyn 软件（www.combosyn.com）计算药物联合的协同效应，发现姜黄素能增加SW620 对5-FU 的敏感性，且姜黄素预处理相比于两药同时干预有更显著的增敏效果（表4～5），剂量-效应曲线见图1～2。

表4 姜黄素同时联合5-FU 对SW620 协同效应的影响

表5 预处理姜黄素联合5-FU 对SW620 协同效应的影响

图1 姜黄素同时联合5-FU 处理SW620 效应曲线

图2 预处理姜黄素联合5-FU 处理SW620 效应曲线

3.2 姜黄素与5-FU 联用对SW620 凋亡的影响 姜黄素预处理组比同时用药联合组对SW620 生长抑制更明显，因此采取姜黄素预处理培养细胞的方法进行凋亡检测。流式细胞分析发现，与对照组比较，联用给药组诱导SW620 细胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），见表6、图3。

3.3 姜黄素与5-FU 联用对SW620 细胞相关凋亡蛋白表达影响 单用姜黄素对SW620 细胞内caspase 家族蛋白表达，差异无统计学意义（P＞0.05），单用5-FU 促进cleaved-PARP 和cleaved-caspase3 蛋白表达（P＜0.05），应用姜黄素预处理与5-FU 联用促进SW620 细胞caspase 家族相关凋亡蛋白（cleaved-PARP、cleaved-caspase3、cleaved-caspase6、cleaved-caspase9）表达（P＜0.01），见图4、表7。由此提示，姜黄素与氟尿嘧啶（5-FU）联用可以协同诱导SW620细胞内相关促凋亡蛋白表达。

4 讨论

5-FU 作为结直肠癌治疗最普遍、疗效相对高的化疗药物［15］，它在人体内会转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，继而抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，从而阻断尿嘧啶脱氧核苷转变为胸腺嘧啶脱氧核苷，最终影响DNA 和RNA 的合成［16］。但5-FU 的长期应用会导致胃肠及血液系统的毒副作用，甚至产生对5-FU 的药物耐受，这会严重影响患者生存质量及抗肿瘤治疗［17］。

表6 姜黄素联合5-FU 对SW620 凋亡率的影响（±s，n＝3）

表6 姜黄素联合5-FU 对SW620 凋亡率的影响（±s，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

结肠癌细胞对5-FU 产生耐受是化疗药物疗效降低的重要原因之一。已有相关研究［18］证实，姜黄素主要通过调节抑癌基因和原癌基因表达，诱导细胞凋亡，逆转肿瘤细胞耐药等途径表现抗肿瘤活性。同时，发现姜黄素能上调P53 和Bax，下调Bcl-2，由此诱导结肠癌细胞凋亡［19］。此外，Mehdi 等［20］发现5-FU 与姜黄素的联合应用可以阻断结肠癌发展，结果显示，在联用的情况下，结肠癌HCT116细胞存活率显著降低，产生细胞周期阻滞并诱导凋亡。此外，还观察到姜黄素可通过NF-κB 信号通路增强5-FU 对结肠癌细胞株生长抑制和促凋亡作用。诸多研究表明，姜黄素作为中药的提取成分，虽不及化疗药物疗效但也具备抗肿瘤作用。因此，探索姜黄素与5-FU 联用对抗肿瘤作用的研究有重大意义，本研究也将为姜黄素作为未来临床辅助化疗药的增效剂提供理论依据。

图3 姜黄素联合5-FU 诱导SW620 凋亡的流式图

图4 姜黄素联用5-FU 对SW620 细胞内相关凋亡蛋白的表达

在本研究中，首先通过MTT 法对5-FU 抑制结肠癌相关细胞株HCT-8、HCT-116、LOVO、SW480、SW620 的生长作用进行对比，得到5-FU 处理以上细胞株48 h，IC50分别为24.62、12.38、4.53、18.49、367.20 μmol／L。由此可知，相比于其他4 株细胞，SW620 对5-FU 的敏感性较弱，针对其展开后续增敏相关实验更具有临床依据及意义。从细胞增殖、细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达等几个方面分析姜黄素与5-FU 联用对SW620 抑制作用。通过CompuSyn软件计算分析发现两种药物联合应用时，姜黄素可明显增进5-FU 对SW620 的杀伤作用，而预处理24 h 相比于同时用药有更明显的效果。为进一步了解姜黄素与5-FU 抑制SW620 增殖的机制，利用FITC-Annexin V／ PI 双染流式细胞技术对SW620 细胞凋亡进行了检测，结果显示两药联用（预处理组）比单药处理发生的凋亡更显著，提示姜黄素可能通过诱导SW620 凋亡来增加其对5-FU 的敏感性。8 μmol／L姜黄素预处理与5 μmol／L氟尿嘧啶（5-FU）联用组能上调SW620 细胞内caspase 家族相关蛋白表达，说明预处理姜黄素与5-FU 联用能协同诱导SW620 细胞内相关凋亡蛋白表达。

表7 姜黄素联用5-FU 对SW620 细胞内相关凋亡蛋白的表达（±s，n＝3）

表7 姜黄素联用5-FU 对SW620 细胞内相关凋亡蛋白的表达（±s，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

综上所述，预处理姜黄素联用5-FU 协同增强对SW620细胞株的杀伤作用，其机制与caspase 半胱氨酸蛋白酶家族有关。有研究［21］显示，腺病毒载体导人caspase-3 基因在获得性药物抗性（acquired drug resistance，ADR）的MCF-7细胞系中发现ADR 细胞比转入前caspase-3 蛋白表达增加，同时也发现前体caspase-3 高表达，对药物的敏感性强。表示caspase 在未来治疗恶性肿瘤化疗药耐药性方面具有重要实际意义，且用caspase 相关诱导凋亡的方法治疗肿瘤将有新的潜能和突破。本实验为临床上姜黄素作为结肠癌化疗药5-FU 的增效剂，减少毒副作用和耐药性提供了初步实验依据，但仍需要进一步的研究验证。