淫羊藿根质量标准的研究

段 萍，万红才，徐作刚，罗洪莲，刘晓艳，徐文芬

（1.黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000）

淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim 最早载于《神农本草经》［1］，生于海拔200～1 800 m 的山坡、草丛、灌丛、沟谷、岩石缝、林下等，分布于贵州、四川、长江流域中下游及南方各省区，其根为应用历史悠久的传统中药，也是贵州常用的苗药，重在补虚、祛风湿，具有补肾阳、强筋骨、助阳益精等功效，主治肾虚阳痿、小淋沥、喘咳、风湿痹痛。淫羊藿含有多种黄酮类活性成分，主要是8-异戊烯基黄酮，为该属植物特有的黄酮类成分，包括双藿苷A、淫羊藿属苷A、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿属苷C 等，目前从巫山淫羊藿根、粗毛淫羊藿根、黔岭淫羊藿根也分离到该类化合物；淫羊藿总黄酮具有抑制破骨细胞、促进成骨细胞生长、抗抑郁、增强免疫调节、保护心脑血管系统、抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等药理活性［2-4］。

2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》 收载了箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿、柔毛淫羊藿、天平山淫羊藿、毡毛淫羊藿、光叶淫羊藿的干燥根作为药用资源［5］，但其质量标准中仅有性状描述。本实验对淫羊藿根来源、性状、鉴别、检查、含有量测定等方面进行研究，以期进一步完善其质量标准。

1 材料

1.1 仪器 TΜ-1901 紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；UV-2600 紫外分光光度计、2010 AHT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SK250LHC 超声波清洗器（上海科导仪器有限公司）；卡玛TLC PLATE HEATER Ⅲ薄层板加热器；AG135 电子天平（十万分之一）、AL204 电子天平（万分之一）（瑞士梅特勒-托利多公司）；安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试剂与药物 朝藿定C（纯度92.6%，批号111780-201803）、淫羊藿苷（纯度94.2%，批号110737-201516）对照品均购于中国食品药品检定研究院，2～10 ℃冷藏；硅胶G 板、硅胶GF254板、硅胶H 板均为青岛海洋化工有限公司生产。乙腈为色谱纯；稀乙醇为50% 乙醇；其他试剂为分析纯；水为娃哈哈纯净水。样品洗净后晒干，粉碎，过3 号筛，置于干燥器中保存，经贵阳中医学院何顺志教授、王悦云副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 来源 本品为淫羊藿属中8 个品种的干燥根，夏、秋两季采挖，洗净，晒干。具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.2 性状 对8 个品种淫羊藿根的性状进行描述，结果见表2。

2.3 鉴别

2.3.1 显微鉴别 本品粉末棕黄色；导管成束或散在，直径10～50 μm，螺纹或网纹，导管分子穿孔板上具多数圆形孔；薄壁细胞类方形、类长方形、不规则形，壁稍厚，具纹孔，多含黄棕色分泌物；木栓细胞类长方形、类方形，直径10～50 μm，具纹孔；木纤维成束或单个散在，呈宽披针形。见图1。

2.3.2 薄层色谱 取本品细粉0.2 g，加乙醇10 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；另取朝藿定C对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 该成分的对照品溶液。按照2015 年版《中国药典》 四部通则0502 薄层色谱法，吸取上述2 种溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（27∶12∶4）下层澄清溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱在对照品相应位置上显相同颜色的斑点，见图2。

2.4 检查 按照2015 年版《中国药典》 四部通则，对水分（通则0832 第二法）、总灰分（通则2302）、酸不溶性灰分（通则2302）进行检查，结果见表3。由于淫羊藿圆柱型根分支少，易清洗；结节型根包裹杂质较多，不易清洗，导致总灰分、酸不溶性灰分测定结果偏差较大，暂定水分含有量不得超过12.0%，总灰分含有量不得超过9.0%，酸不溶性灰分含有量不得超过6.0%。

表2 淫羊藿根外观性状Tab.2 Appearance characteristics of the roots of E.brevicornu

图1 淫羊藿根显微鉴别Fig.1 Microscopic identification of the roots of E.brevicornu

2.5 浸出物 按照2015 年版《中国药典》 四部通则2201 项下醇溶性浸出物测定法中的热浸法测定，用稀乙醇作为溶剂，结果见表3，暂定浸出物含有量不得少于18.0%。

图2 淫羊藿根TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of the roots of E.brevicornu

2.6 含有量测定

2.6.1 总黄酮［6］

2.6.1.1 测定方法 精密量取朝藿定C 测定项下的供试品溶液0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含10 μg该成分的对照品溶液。取2 种溶液，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法（通则0401）在270 nm 波长处测定吸光度，计算含有量。

2.6.1.2 对照品溶液制备 精密称取淫羊藿苷对照品10.43 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇超声溶解并稀释至刻度，作为贮备液，精密量取1 mL，置于10 mL 量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，即得（9.825 1 μg／mL）。

2.6.1.3 供试品溶液制备 精密量取朝藿定C 测定项下的供试品溶液0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.6.1.4 线性关系考察 精密量取“2.6.1.2”项下贮备液，甲醇制成1.965、4.913、9.825、19.650、29.475 μg／mL，按“2.6.1.1”项下方法测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝0.041 5X+0.007 4（r＝0.999 9），在1.965～29.475 μg／mL 范围内线性关系良好。

表3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物测定结果Tab.3 Determination results of moisture，total ash，acid insoluble ash and extract

2.6.1.5 精密度试验 精密吸取“2.6.1.2”项下对照品溶液，按“2.6.1.1”项下方法测定吸光度6 次，测得其RSD 为0.01%，表明仪器精密度良好。

2.6.1.6 稳定性试验 取样品（S1），按“2.6.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.1.1”项下方法于0、6、12、16、20 h 测定吸光度，测得其RSD为0.7%，表明溶液在20 h 内稳定性良好。

2.6.1.7 重复性试验 按“2.6.2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，各取0.5 mL 置于50 mL量瓶中，按“2.6.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.1.1”项下方法测定吸光度，测得淫羊藿苷含有量RSD 为1.5%，表明该方法重复性良好。

2.6.1.8 加样回收率试验 称取淫羊藿苷对照品78.22 mg，置于150 mL 量瓶中，加稀乙醇至刻度，作为回收对照品溶液（491.22 μg／mL）。取6 份样品（S1），每份约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入回收对照品溶液20 mL，按“2.6.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.1.1”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表4。

表4 总黄酮加样回收率试验结果Tab.4 Results of recovery tests for total flavonoids

2.6.1.9 样品含有量测定 取15 份供试品溶液，各量取0.5 mL，置于50 mL 量瓶中，按“2.6.1.1”项下方法测定吸光度，以淫羊藿苷为基准计算含有量（按干燥品计），结果见表5。参照2015 年版《中国药典》 一部淫羊藿总黄酮测定项下规定限度，建议将含有量限度暂定为按干燥品计算，含淫羊藿苷（C33H40O15）不得少于6.0%。

表5 各成分含有量测定结果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%）

2.6.2 朝藿定C［7-9］

2.6.2.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（25∶75）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。理论塔板数按朝藿定C峰计，应不低于3 000。见图3～4。

2.6.2.2 对照品溶液制备 精密称取朝藿定C 对照品13.17 mg，置于25 mL 量瓶中，稀乙醇超声溶解并稀释至刻度，作为贮备液，量取5 mL，置于10 mL量瓶中，乙醇稀释至刻度，即得（0.244 mg／mL）。

2.6.2.3 供试品溶液制备 取样品（S1）约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，静置过夜，超声60 min，放冷，稀乙醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

图3 淫羊藿根HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of the roots of E.brevicornu

图4 各样品HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of various samples

2.6.2.4 线性关系考察 精密量取“2.6.2.2”项下贮备液 2、4、8、12、16、20 μL，在“2.6.2.1”项色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得方程为Y＝1 766.284X-121.810（r＝1.000 0），在0.976～9.756 μg 范围内线性关系良好。

2.6.2.5 精密度试验 精密吸取“2.6.2.2”项下对照品溶液，在“2.6.2.1”项色谱条件下连续进样6 次，测得朝藿定C 峰面积RSD 为0.18%，表明仪器精密度良好。

2.6.2.6 稳定性试验 取供试品溶液（S1），在“2.6.2.1”项色谱条件下于0、6、12、16、20 h进样，测得朝藿定C 峰面积RSD 为0.7%，表明供试品溶液在20 h 内稳定性良好。

2.6.2.7 重复性试验 取样品（S1）6 份，精密称定，按“2.6.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.2.1”项色谱条件下测定，测得朝藿定C 含有量RSD 为1.4%，表明该方法重复性良好。

2.6.2.8 加样回收率试验 称取朝藿定C 对照品23.80 mg，置于200 mL 量瓶中，加稀乙醇适量，超声溶解，放冷，加稀乙醇至刻度，作为回收对照品溶液（0.110 2 mg／mL）。取6 份样品（S1），每份约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入回收对照品溶液20 mL，按“2.6.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.2.1”项色谱条件下测定，计算回收率。结果见表6。

表6 朝藿定C 加样回收率试验结果Tab.6 Results of recovery tests for epimedin C

2.6.2.9 耐用性试验 取“2.6.2.7”项下供试品溶液、“2.6.2.2”项下对照品溶液，按“2.6.2.1”项下方法对不同色谱仪、色谱柱、检测波长、温度等条件进行考察，测得RSD 均小于2.4%，表明该方法耐用性良好。

2.6.2.10 样品含有量测定 取15 批样品，按“2.6.2.3”项下方法制备供试品溶液，取“2.6.2.2”项下对照品溶液，在“2.6.2.1”项色谱条件下测定，计算含有量（以干燥品计），结果见表5。8个品种15 批样品中朝藿定C 含有量为0.96%～5.95%，参照2015 年版《中国药典》 一部巫山淫羊藿含有量测定项下规定限度，建议将含有量限度暂定为按干燥品计算，含朝藿定C（C39H50O19）不得少于1.0%。

2.6.2.11 朝藿定C、淫羊藿苷含有量比较 不同品种淫羊藿根、叶中黄酮类成分含有量的差异很大；不同部位中淫羊藿苷含有量依次为叶高于根高于茎，但大部分品种根、叶中朝藿定C 含有量都较高［10-11］。取“2.6.2.3”项下供试品溶液，按2015 年版《中国药典》 一部淫羊藿项下方法测定淫羊藿根、朝藿定C 含有量，结果见表7，可知后者明显更高。

表7 各样品中朝藿定C、淫羊藿苷含有量比较（%）Tab.7 Comparison of contents of epmedin C and icariin in various samples（%）

3 讨论

黔岭淫羊藿、水城淫羊藿是贵州省独有品种，前者收载于2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》 黔淫羊藿项下（地上部分），是当地主流品种之一，蕴藏量较大［12-13］。因此，建议在淫羊藿根的来源中增加黔岭淫羊藿、水城淫羊藿根，以扩大贵州省该药材覆盖范围。

研究表明，淫羊藿主要活性成分为黄酮类，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷含有量较高，5 种成分总量约占淫羊藿总黄酮的10%～20%［10］。2015 年版《中国药典》 一部淫羊藿（叶）以淫羊藿苷为指标成分（不得少于0.5%），巫山淫羊藿（叶）以朝霍定C 为指标成分测定含有量（不得少于1.0%）。本实验检测了8 批淫羊藿根中淫羊藿苷、朝霍定C 含有量，发现前者较低，均未达到《中国药典》 规定限度；后者较高，最低也有0.86%，与巫山淫羊藿含有量测定项下朝藿定C 规定限度相近，故以其为淫羊藿根的指标成分。

淫羊藿在加热炮制过程中，与朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ母核相同的其他黄酮苷类成分可脱去糖基，转化为淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ［11］，导致朝藿定C 含有量下降，淫羊藿苷含有量升高。因此，建议淫羊藿根药材洗净后晒干。

将淫羊藿苷作为淫羊藿的指标成分时，其含有量在某些品种中并不能达到《中国药典》 标准，易造成药材资源大量浪费［14-16］。因此，同时测定淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 的总含有量作为淫羊藿质量控制标准较为合理，但其检验成本较高，有待进一步寻求更为理想的方法。