UPLC 法测定生、制白术配伍枳术丸中10 种成分

臧彬如单国顺贾天柱张诗雯周改莲

（1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；2.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

枳术丸是仅由白术、枳实2 味中药组成的治疗脾胃内伤的经典方剂［1］，始见于李东垣的《内外伤辨惑论》［2］，后被2015 年版《中国药典》 一部所收载［3］。方中白术量重于枳实1 倍，乃补重于消，寓消于补［4］；枳实药性峻烈，需以麸炒缓和其破气之力［5］，用于脾胃虚弱、食少不化、脘腹痞满等症［6］。白术为君药，其味苦、性温，可健脾益气、燥湿利水［7-9］；枳实为臣药，其味苦、性寒，可下气化滞、消痞除满［10］。现代药理研究表明，枳术丸还能治疗小儿厌食、功能性消化不良等症状［11］。

近年来，有学者发现麸炒可以促进白术中苍术酮氧化为白术内酯，但与枳实配伍后却可使白术内酯还原为苍术酮［12-13］，这也证明单味药的炮制机理并不等同于复方中该药炮制前后的组方和配伍机制。此外，《内外伤辨惑论》 中枳术丸由麸炒枳实、白术组成，而被《中国药典》 所收载的由麸炒白术、枳实组成，且临床上麸炒白术以健脾消食、和胃作用为主，这又恰与枳术丸治痞、消食、强胃的功效相应。本实验采用UPLC 法测定生白术、制枳术丸中10 种成分的含有量，以期证实组方中白术与麸炒枳实配伍的合理性。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLC H-Class 色谱仪（沃特世科技上海有限公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA1004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；AE240型电子分析天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）；WGL-125B 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；RO-2640P 型超纯水器（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 白术内酯Ⅰ（批号111127）、白术内酯Ⅱ（批号150917）、白术内酯Ⅲ（批号151107）对照品（四川省维克奇生物科技有限公司）；橙皮苷（批号YJ-160226）、柚皮苷（批号100002）、芸香柚皮苷（批号101222）、柚皮素（批号100368）、橙皮素（批号100456）、辛弗林（批号YJ-151012）对照品（江苏永健医药科技有限公司）；荷叶碱（批号DST180209-051）对照品（成都德思特生物技术有限公司），纯度均大于98%。

白术购于安徽亳州、浙江丽水、湖北恩施，枳实购于江西省，荷叶（批号170701）购于安徽致良中药饮片有限公司，均经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为正品。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（德国Merck 公司）；水为超纯水，由RO-2640P 超纯水器制备。

2 方法与结果

2.1 枳术丸制备 按处方比例称取白术生品、炮制品各500 g，麸炒枳实250 g，粉碎，过3 号筛，混匀。另取荷叶75 g，加40 倍量水（没过荷叶表面）煎煮1 h，放凉过滤，残渣加10 倍量水煎煮1 h，放凉过滤，合并2 次滤液浓缩，浓缩液9 500 r／min离心10 min 后取上清液，用煎液泛丸，干燥，即得。

2.2 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、柚皮素、橙皮素、辛弗林、荷叶碱、白术内酯Ⅱ检测波长为283 nm，白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ为220 nm；进样量2 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 对照品溶液制备 精密量取对照品溶液适量，甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，摇匀，制成含白术内酯Ⅰ1.123 mg／mL、白术内酯Ⅱ0.115 mg／mL、白术内酯Ⅲ1.061 mg／mL、荷叶碱0.144 mg／mL、橙皮苷0.130 mg／mL、橙皮素0.125 mg／mL、柚皮苷0.134 mg／mL、柚皮素0.130 mg／mL、辛弗林0.162 mg／mL、芸香柚皮苷0.144 mg／mL 的溶液，即得，密封避光保存。

2.4 供试品溶液制备 取枳术丸适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL 浸泡30 min，称定质量，超声处理（700 W、50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，甲醇定容于25 mL量瓶中，混匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.5 系统适用性试验 精密吸取供试品、对照品溶液各2 μL，在“2.2”项色谱条件下进样，测得辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ保留时间分别为1.219、10.707、11.369、11.851、13.423、15.757、16.513、21.233、23.215、24.910 min，且分离度良好，理论塔板数均不低于15 000。见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取“2.3”项下各对照品溶液，甲醇稀释成6 个质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6.2 精密度试验 称取“2.1”项下样品（浙江丽水）约2.0 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下连续进样6 次，测得辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ峰面积RSD 分别为2.53%、0.5%、1.45%、2.24%、2.81%、3.02%、0.46%、2.04%、1.45%、1.63%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 称取“2.1”项下样品（浙江丽水）约2.0 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件下于制备后0、2、4、8、12、24 h 进样，测得辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ峰面积RSD 分别为 2.85%、2.51%、1.96%、0.47%、3.58%、2.72%、2.44%、2.78%、2.96%、3.1%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.4 重复性试验 称取同一样品6 份（浙江丽水），每份约2.0 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，测得辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ峰面积 RSD 分别为 2.93%、2.48%、2.25%、2.55%、2.43%、2.53%、2.75%、1.75%、1.83%、1.28%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 称取同一样品约1.0 g，共6 份，加入辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ对照品适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，计算回收率。结果，辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷叶碱、柚皮素、橙皮素、白术內酯Ⅲ、白术內酯Ⅰ、白术內酯Ⅱ平均加样回收率分别为100.6%、98.3%、98.9%、99.0%、97.5%、97.7%、98.2%、98.2%、98.7%、100.0%，RSD分别为2.96%、1.89%、2.33%、2.50%、2.22%、2.70%、2.02%、2.17%、2.50%、3.16%。

2.7 样品含有量测定 称取3 个产地白术鲜品和1 个产地枳实鲜品适量，按“2.1”“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，计算含有量。结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论与结论

3.1 指标性成分选择 白术中内酯类成分具有促进胃肠运动和营养成分吸收的作用，是其主要活性物质［14-15］，因此，本研究选取白术内酯Ⅰ～Ⅲ作为指标。枳实中主要活性物质为生物碱及黄酮两大类，其中以橙皮苷、柚皮苷及芸香柚皮苷为代表的黄酮类成分具有抑制平滑肌收缩、改善功能性消化不良大鼠的胃排空和抗氧化抗炎等作用，是枳实中消食的主要活性物质［16-18］。由于枳术丸中使用的是麸炒枳实，炮制的过程可导致黄酮苷类成分的苷键发生断裂，得到其苷元类物质，因此，本研究选取了黄酮苷类物质橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷及其苷元橙皮素、柚皮素作为指标性。此外，生物碱类成分以辛弗林为代表，被《中国药典》 收载，本研究也以其为检测指标之一；荷叶汁虽然只作为白术和枳实的粘合剂，但它含有大量生物碱，具有降脂、抑菌等作用［19］，故按照《中国药典》 规定也选择其所含荷叶碱作为指标。

3.2 流动相选择 本研究比较了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈，发现甲醇-水溶液分离效率较低，在220 nm 波长下的末端吸收情况较为严重，而乙腈-水系统则具有相对好的色谱分离效果。为了有效改善部分色谱峰的拖尾现象，本研究还加入甲酸以提高分离度。最终，确定流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸。

3.3 色谱柱选择 本实验考察了ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）2 种色谱柱，发现BEH C18色谱柱出峰少，色谱峰的保留时间延长，而HSS T3色谱柱显著提高了峰容量及对色谱峰的分离效果，这可能与部分成分具有强极性有关，而该柱子对其具有更好的保留效果。因此，本实验选择HSS T3色谱柱。

3.4 提取方式选择 本实验考察了25%、50%、75%、100%甲醇在超声法和回流法下的提取效率，发现100%甲醇最高，而2 种提取方法之间没有显著性差异，但回流法所用时间较长，重复性较差。因此，本实验选择100%甲醇超声提取。

3.5 白术内酯类成分比较 本实验发现，不同产地生白术中内酯类成分差异较大，这可能与生长环境及采收、加工方式有关。比较生制品白术与麸炒枳实配伍后白术内酯类成分的变化趋势显示，在不同产地白术中含有量均较高的白术内酯Ⅲ在白术麸炒的过程中，仅有部分降低，而经配伍后明显下降，同时白术内酯Ⅰ含有量明显升高，这可能是由于白术在炮制的过程中促进了白术内酯Ⅲ向白术内酯Ⅰ的转化，有利于增强麸炒白术的补益作用［14-15］，而配伍后促进白术中有效成分的溶出（转化）也表明麸炒枳实与麸炒白术配伍的必要性和合理性。

3.6 黄酮类成分比较 通过对比枳实炮制前后及配伍生制白术后黄酮类成分的含有量发现，枳实生制品中橙皮苷最高，麸炒后枳实中黄酮苷类成分明显降低，而在与白术进行配伍之后反而升高，表明与白术配伍时对黄酮苷类成分可起到保护作用。同时，麸炒后枳实中黄酮苷元类成分含有量明显升高，而与白术配伍后降低，进一步表明白术具有增加黄酮苷类成分、降低黄酮苷元类成分的作用。枳实中黄酮苷类成分为其增强胃肠功能的主要活性物质，而麸炒在降低了燥性挥发油类成分含有量的同时，也促进了苷键的断裂，使其改善脾虚患者胃肠功能的作用降低；与白术配伍后可促进具有增强胃肠蠕动作用的苷类成分含有量增加，以保证其健脾消积的作用。枳实中主要活性物质辛弗林经麸炒后由于温度的影响，其结构遭到破坏，含有量降低，而与白术配伍后增加，同样体现出配伍的意义［20-21］。另外，荷叶碱含有量在麸炒白术制枳实中更高，也可证实枳术丸以麸炒白术入方的合理性。

本研究从复方配伍与炮制的角度，证明了枳术丸中选用麸炒白术与麸炒枳实配伍的合理性。今后，将继续从入血成分种类及代谢情况入手，比较生、制白术配伍枳术丸的差异，以期从体内实验探讨组方规律及其合理性。