梅花鹿鹿茸多糖的提取工艺优化及抗衰老的作用

崔长升 于淼 王任晶 赵晋莹 刘莉 汪莹 闫凯莉 齐滨 赵大庆

(长春中医药大学 1药学院，吉林 长春 130117；2针灸推拿学院；3吉林省人参科学研究院)

《中国药典》中记载，鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、羸瘦、神疲、畏寒、眩晕、耳鸣、耳聋、腰脊冷痛、筋骨痿软、崩漏带下、阴疽不敛〔1〕。现代药理学表明，鹿茸具有抗应激、缓解骨质疏松、减肥降脂、抗氧化和抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等功效，可调节生殖系统、免疫系统、心血管系统、神经系统等〔2～4〕。鹿茸中主要含有氨基酸、脂类、多肽、多糖、多胺、无机元素、蛋白质、激素样物质、生物碱基等化学成分〔5～8〕，其中多糖是活主要性成分之一。鹿茸多糖能够提高机体的全面免疫功能，提高防御能力及抗肿瘤能力〔9〕。本研究拟系统研究梅花鹿鹿茸多糖的提取工艺，并对其抗衰老的活性进行初步探究。

1 材料与方法

1.1材料 超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT )活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成科技有限公司；D-半乳糖购自上海惠世生化试剂有限公司；D-无水葡萄糖(批号 201704)购自中国食品药品检定研究院；其他试剂为分析纯。梅花鹿鹿茸药材采自吉林省长春市双阳鹿场，由长春中医药大学药学院鉴定为鹿科动物梅花鹿雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。样品留存于长春中医药大学药学院。

UV-2550型紫外可见分光光度计购自日本岛津公司；DZF-6050型电热恒温真空干燥箱购自上海博讯实业有限公司；ST-40R型高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MS204S 型分析天平购自瑞士梅特勒-托利多公司；酶标仪(Infinite M200 Pro型)、石蜡切片机(RM2235型)购自德国莱卡测量系统设备有限公司；自动包埋机(EG1150H型)、烘片机(HI1220型)、铺片机(HI1210型)购自德国莱卡测量系统设备有限公司；体视显微镜(SMZ25型)购自北京恒三江仪器销售有限公司。

1.2实验动物 昆明种SPF级小鼠〔动物合格证号：SCXK(吉)2016-0003〕，雌雄各半，体重(20±2)g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.3鹿茸多糖提取工艺的优化 按文献〔10〕及课题组前期单因素的实验结果，选择料液比，提取时间，提取次数3个因素，每个因素设3个水平，进行正交实验优化，以多糖提取率作为考察指标，多糖的含量测定采用苯酚硫酸法，实验因素水平分配见表1。

表1 因素水平表

1.4鹿茸多糖的提取 取一定量鹿茸粉末，石油醚浸泡12 h脱脂，之后加55倍体积 0.2 mol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液100 ℃提取2 h，4 000 r/min离心15 min，连续提取2次，合并上清液，浓缩到原体积的1/3～2/3，加入3倍体积95%乙醇，充分搅拌，4℃浸泡12 h，离心，收集醇沉物，至通风处晾干后，将沉淀物加水复溶，用sevage法除蛋白2～3次，透析48 h，浓缩，冷冻干燥得鹿茸多糖。

1.5动物分组及造模给药 实验开始前，小鼠自由摄食饮水，适应性饲养7 d，称重、编号后开始正式试验。50只小鼠随机分成空白(Control)组，老年模型(AM)组，鹿茸多糖低剂量(LR-L)组，鹿茸多糖中剂量(LR-M)组和鹿茸多糖高剂量组(LR-H)，雌雄各5只。Control组以等体积的蒸馏水灌胃，其他组颈背部皮下注射D-半乳糖〔给药剂量为130 mg/(kg·d)〕30 d，AM组灌胃蒸馏水10 ml/(kg·d)，LR-L、LR-M、LR-H组每天分别灌胃浓度为125 mg/kg、250 mg/kg和500 mg/kg的鹿茸多糖样品，共30 d。

1.6生化指标检测 给药后30 d禁食不禁水，12 h后，各组按1.5项下给药，30 min后脱颈处死，摘眼球取血0.5～1.0 ml，4℃低温离心、收集血清并保存。按照试剂盒规定的方法测定SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量。

1.7组织切片观察 肝脏于4%多聚甲醛中固定，用于组织切片观察。48 h后，从固定液中取出肝组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，包埋，制作石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色，中性树胶封片，显微镜观察〔11〕。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件采用单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1正交实验优化鹿茸多糖的提取工艺 以多糖提取率为指标，对料液比、提取时间及提取次数3个因素进行考察。结果见表2。不考虑交互作用，进行方差分析，结果见表3。由R值可知，各因素影响的大小依次为料液比>提取时间>提取次数。通过方差分析可知，3个因素中，料液比、提取时间具有显著影响(P<0.05)，提取次数不显著。综合分析，通过正交试验优化的鹿茸多糖最佳提取工艺为料液比1∶15，水浴回流100℃提取2次，每次2 h。鹿茸多糖的提取率为1.6%。

表2 正交实验结果

k1、k2、k3为均值；R为极差

表3 方差分析结果

2.2体征和行为观察结果 正式实验前各组活动、饮食正常、毛色光亮。D-半乳糖造模30 d后，与Control组相比，AM组少动、饮食减少、体重减轻，毛色灰暗、竖毛，开始呈现衰老体征。给药鹿茸多糖30 d后，与AM组对比，鹿茸多糖各剂量组活泼、皮毛较光亮、饮食正常，与Control组相比，行为体征无明显差异。

2.3血清生化指标检测结果 AM组与Control组相比，血清中GSH-Px、SOD、CAT活力明显下降(P<0.01,P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.01)。与AM组相比，LR-H组、LR-M组及LR-L组可显著提高SOD，CAT和GSH-Px的活力(P<0.01)及降低MDA含量(P<0.01，P<0.05)。见表4。

2.4鹿茸多糖对D-半乳糖致衰老小鼠肝组织结构的影响 Control组肝脏组织结构正常，肝细胞相互连接形成肝板，以中央动脉为中心向周围呈辐射状形成肝小叶，肝细胞之间空隙形成肝血窦，细胞质丰富，细胞核较大，核仁明显，无炎性细胞浸润。AM组肝细胞内炎性细胞较多，胞质疏松，细胞界限模糊，肝血窦不明显，染色质固缩；LR-L、LR-M组肝脏组织结构正常，着色清晰，肝板排列不整齐，炎性细胞浸润减轻，染色质固缩现象缓解；LR-H组肝脏组织结构正常，着色清晰，肝血窦明显，结构完整，细胞界限明显，胞核胞质未发现异常，形态结构较好。见图1。

表4 鹿茸多糖对SOD、CAT、GSH-Px的活力和MDA的含量影响

与AM组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

箭头表示炎性细胞图1 各组肝组织切片(HE，×200)

3 讨 论

鹿茸作为珍贵的滋补药材，具有补虚作用，抗衰老，壮肾阳，益精血，增强免疫力等功效〔12〕，随着研究的深入，对鹿茸多糖等成分的研究越来越引起国内外研究人员的重视。以往鹿茸多糖的提取多采用超声、水煎煮的方法〔13〕，缓冲盐溶液作为溶剂提取，sevage法除蛋白，透析，与现有工艺相比〔14，15〕，所得鹿茸多糖纯度、提取率较高。

长期给小鼠注射一定剂量的D-半乳糖，会在体内代谢得到大量的半乳糖醇，不能被进一步代谢因而堆积起来，影响细胞正常的渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱〔16〕。通过大量的文献检索与对比，目前我国建立衰老模型最常用的方法是皮下注射一定剂量的D-半乳糖〔17〕。董会萍〔18〕研究发现最佳D-半乳糖小鼠衰老模型的剂量为120～150 mg/(kg·d)，颈部皮下注射与腹腔注射无明显差异。故本实验采用颈部皮下注射D-半乳糖致衰老模型，给药剂量为130 mg/(kg·d)。过量的D-半乳糖破坏并消耗机体抗氧化防御系统，从而造成机体自由基失衡。SOD、CAT及GSH-Px活性高低的变化反映了机体抗氧化能力的大小，活性越高，抗氧化能力越强，MDA 含量的高低反映了机体自由基累积及脂质过氧化损伤的程度，常使用以上4个指标评价抗氧化能力〔19,20〕。D-半乳糖可导致衰老的同时，也会致肝损伤，肝组织结构发生改变，本文同时观察各组小鼠肝组织的病理变化〔21,22〕。

本研究表明鹿茸多糖具有抗氧化应激损伤的保护作用，其机制可能与清除体内自由基有关。