定量分析幽门螺杆菌根除前后部分肠道菌群的改变*

唐源淋 陈 烨

深圳市第三人民医院消化内科1(518114) 南方医科大学南方医院消化科 广东省胃肠疾病重点实验室2

背景：全球约半数人群存在幽门螺杆菌(Hp)感染，根除Hp是治疗其感染相关疾病的重要方法。目的：分析Hp根除前后部分肠道菌群的改变，探讨铋剂四联疗法对肠道微生态的影响。方法：纳入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民医院发现Hp感染阳性、接受铋剂四联疗法根除治疗并成功根除Hp的个体，采集其Hp根除前和根除治疗结束后3 d内的粪便标本，提取基因组DNA，采用菌属特异性引物行real-time PCR定量分析。结果：与根除前相比，Hp根除后粪便肠杆菌属、肠球菌属数量明显增加，双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属和总菌数量明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，乳酸杆菌属数量无明显变化(P>0.05)。结论：采用铋剂四联疗法根除Hp可影响肠道菌群结构，导致肠道微生态失衡。

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的关系已得到公认[1]。全球约半数人群存在Hp感染，根除Hp是治疗其感染相关疾病的重要方法。目前国、内外Hp感染处理共识均推荐使用由质子泵抑制剂(PPI)、铋剂联合两种抗菌药物组成的四联方案根除Hp[2-3]。既往研究发现Hp感染对胃内正常菌群结构有显著影响[4]，关于Hp根除治疗对肠道微生态的影响，现有研究结果不一。本研究通过分析Hp根除前后部分肠道菌群的改变，探讨铋剂四联疗法对肠道微生态的影响。

对象与方法

一、研究对象

纳入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民医院体检中心发现Hp感染阳性、首次接受Hp根除治疗并成功根除Hp的个体，采集其Hp根除前后的粪便标本进行定量分析。采集体检中心同期健康体检者的粪便标本用于引物特异性检测。纳入标准：①入组前14C-尿素呼气试验(14C-UBT)结果阳性(DOB≥100)，治疗结束后4周复查14C-UBT结果阴性(DOB<100)；②既往未接受过Hp根除治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并严重心、脑、肺、肾等器官功能不全；②合并慢性腹泻、炎症性肠病等已知可引起肠道菌群紊乱的疾病；③胃肠道手术史；④进入试验前4周应用PPI、抗菌药物和(或)微生态制剂。研究方案经医院伦理委员会审核、批准，研究对象均签署知情同意书。

二、方法

1. Hp根除治疗：采用铋剂四联疗法行Hp根除治疗：艾司奥美拉唑镁肠溶片20 mg口服，2次/d+胶体果胶铋胶囊200 mg口服，2次/d+阿莫西林胶囊1 000 mg口服，2次/d+克拉霉素缓释片0.5 g口服，2次/d，疗程14 d。根除治疗过程中记录药物相关不良反应发生情况。治疗结束后4周复查14C-UBT。

2. 粪便标本采集：Hp根除前和根除治疗结束后3 d内，于排便后2 h内收集粪便标本并储存于密闭储存盒内，迅速置入-80 ℃低温冰箱中保存。

3. 粪便基因组提取：每例粪便样本称取200 mg，使用TIANamp粪便DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按试剂盒说明书操作提取基因组DNA，-20 ℃保存。

4. PCR引物设计：根据文献报道设计肠杆菌属、肠球菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属的菌属特异性引物[5-6]和总菌引物[7]，并在BLAST数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)内比对引物序列的特异性(表1)。

5. PCR引物特异性检测：提取健康体检者粪便基因组DNA，行常规PCR扩增。反应体系总体积25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(温度见表1)，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，结果显示电泳图中除目的条带外未见明显非特异性扩增，提示引物特异性好，可用于real-time PCR。

6. Real-time PCR：试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。将质粒标准品连续10倍稀释，获得10～107系列拷贝数的标准品，以之为模板构建标准曲线。反应体系总体积20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(温度分别为肠杆菌属58 ℃，肠球菌属52 ℃，双歧杆菌属57 ℃，乳酸杆菌属58 ℃，拟杆菌属60 ℃，梭菌属60 ℃，总菌60 ℃)，72 ℃ 30 s，共45个循环。反应结束后进行熔解曲线分析。将待测粪便DNA适当稀释后，反应体系和条件同上，行real-time PCR。检测重复3次，结果取均值。

三、统计学分析

应用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以M(P25,P75)表示，两组间比较采用两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR菌属特异性引物和总菌通用引物信息

结 果

一、一般情况

共50例成功根除Hp并符合筛选标准的患者纳入研究，其中男性30例，女性20例，平均年龄(30±10)岁。根除治疗过程中5例(10.0%)患者出现恶心，7例(14.0%)出现腹胀，15例(30.0%)出现腹泻，5例(10.0%)出现便秘，少数患者同时有上述2～3项症状。

二、Hp根除前后主要肠道菌群改变

Real-time PCR检测显示，与根除前相比，Hp根除后粪便肠杆菌属、肠球菌属数量明显增加，双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属数量明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，乳酸杆菌属数量无明显变化(P>0.05)，总菌数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05；表2、图1)。

讨 论

Hp于1983年首次从胃黏膜中被成功分离，其可在强酸性环境下稳定定植，通过产生CagA、VacA等细胞毒素以及代谢产物的直接破坏作用和介导炎性反应，导致胃黏膜持续性损害，与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃MALT淋巴瘤的发病密切相关。随着对Hp研究的日益深入，越来越多的胃肠外疾病，如特发性血小板减少性紫癜、不明原因缺铁性贫血等亦被发现与Hp感染相关[2-3]。我国人群Hp感染率在50%以上，根除Hp是治疗其感染相关疾病的重要方法，可修复胃黏膜，促进溃疡愈合，降低溃疡复发和胃癌发生风险。国、内外Hp感染处理共识均推荐使用由PPI、铋剂联合两种抗菌药物组成的四联疗法根除Hp，疗程为10 d或14 d[2-3]。

表2 Hp根除前后主要肠道菌群改变(M, lg copies/g粪便)

肠道内细菌是一个巨大的微生态平衡系统，其平衡依赖于各种菌群种类、数量、定居部位等多方面的平衡，菌群之间相互协调、相互制约，共同构成整体平衡的微生态系统。既往研究显示，抗菌药物的不当使用可引起肠道菌群失调，影响程度取决于药物的抗菌谱及其剂量、给药途径、使用时间、肠道内药物浓度等[8-11]。Barc等[12]应用含人类粪便中主要菌群的小鼠模型研究阿莫西林克拉维酸对肠道微生态的影响，结果显示用药后肠杆菌属和普氏菌属数量显著增加，优杆菌属和梭菌属数量显著减少。另一项应用高通量技术分析抗菌药物对成人肠道菌群结构影响的研究[10]显示，大剂量抗菌药物可显著改变拟杆菌、双歧杆菌、梭菌、肠杆菌和乳酸杆菌数量，不同抗菌药物对不同菌种的影响各不相同。且抗菌药物的滥用或不规范使用可选择并富集耐药菌株[13-15]，耐药菌大量繁殖导致菌群比例发生变化，造成肠道微生态失衡。因此，规范、合理地使用抗菌药物具有重要意义。

图1 Hp根除前后主要肠道菌群改变(real-time PCR)

铋剂四联疗法Hp根除治疗方案中含有两种抗菌药物，药物剂量大，疗程较长，治疗过程中部分患者会出现不同程度的恶心、呕吐、腹胀、腹泻、便秘、食欲不振等一系列胃肠道功能紊乱症状，推测根除Hp造成的胃肠道微生态环境变化可能参与了这些症状的发生。当前日益升高的Hp根除失败率以及多重耐药的出现是否与根除治疗所致的继发性菌群失调存在关联，亦有待明确。目前Hp根除治疗药物对肠道微生态的影响正逐步受到广泛关注。本研究选取6个具有代表性的肠道菌群，通过定量分析其在铋剂四联疗法根除Hp前后的改变，探讨根除治疗对肠道菌群的影响，以期为益生菌在Hp根除治疗中的应用提供临床依据。

本组50例行铋剂四联疗法根除治疗的Hp阳性患者中，分别有5例、7例、15例和5例出现恶心、腹胀、腹泻、便秘等胃肠道功能紊乱症状。与根除前相比，Hp根除后粪便肠杆菌属、肠球菌属数量显著增加，双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属和总菌数量显著减少，乳酸杆菌属数量则无明显变化，证实Hp根除治疗会对部分肠道菌群产生影响，导致肠道微生态失衡。国内学者既往采用细菌培养技术的研究结果亦显示Hp根除治疗对肠道菌群有显著影响[16-17]。传统的粪便细菌培养方法存在费时、培养要求高、影响因素多等问题，real-time PCR、宏基因组测序技术能较完整地保留肠道微生物的遗传信息，结果更接近菌群的真实概况，在研究菌群中微生物特定基因的功能、代谢通路等方面具有明显优势。但宏基因组测序也存在对测序片段进行分装的计算量大、参考数据库不完善、算法的准确性对后续菌群分析影响大、测序深度不够时对稀有物种的敏感性不高、费用昂贵、操作复杂等不足，难以广泛应用于临床检测。Real-time PCR则克服了宏基因组测序特征维度高、对稀有物种不敏感、生物学背景弱等缺点，方法简单、易操作，敏感性和特异性高，适合在临床实践中开展。

Hp根除治疗相关胃肠道微生态失衡可能导致细菌移位、细菌过度生长和肠源性感染，从而影响患者预后，因此针对菌群失调的治疗显得尤为重要。峗向东[18]的研究发现，双歧杆菌活菌制剂能有效防治Hp根除治疗引起的肠道菌群失调。除抗菌药物外，Hp根除治疗方案中的PPI亦对胃肠道微生态有显著影响。肖丽君[19]的研究表明，Hp根除治疗可显著升高胃内pH值，使机体抵御外源性病原体的天然屏障受损，导致胃内细菌过度生长；联合使用双歧杆菌三联活菌制剂则可减少根除治疗相关的胃内细菌生长，胃液pH值大于4时该作用尤为明显。有研究[20]发现，在长期使用PPI的人群中，21%存在小肠细菌过度生长(SIBO)。对于单纯SIBO病例，使用益生菌制剂即可能达到肠道去污和症状缓解[21]，慢性SIBO患者则应考虑抗菌药物利福昔明治疗[22-23]。国内贺星等[24]的研究探讨了利福昔明与双歧杆菌三联活菌制剂序贯治疗SIBO的效果，结果显示与单纯利福昔明治疗相比，序贯治疗可显著提高小肠细菌转阴率和临床疗效。杨娟等[25]采用利福昔明联合酪酸梭菌制剂治疗SIBO，亦取得良好效果。近年来，越来越多的临床研究验证了在传统三联或四联疗法基础上加用乳酸杆菌或布拉酵母菌可提高Hp根除率，因此欧洲最新Maastricht Ⅴ共识报告建议基于已显示的临床效果选择特定益生菌作为Hp根除治疗的辅助用药[2]。

综上所述，我国人群Hp感染率高，阳性患者应接受Hp根除治疗。国、内外共识推荐的铋剂四联疗法可影响肠道菌群结构，表现为肠杆菌属、肠球菌属数量增加，双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属和总菌数量减少，导致肠道微生态失衡。然而本研究只采集了Hp根除后单一时间点的粪便标本，故未能进一步明确肠道菌群结构随时间推移的变化，对于不同Hp根除治疗方案对肠道微生态是否具有不同影响，亦缺乏足够的临床证据，有待后续研究进一步完善。目前益生菌在消化系统中的作用机制及其生物学特性和行为尚未完全明确，在临床应用方面亦存在诸多问题，如益生菌菌株的选择、治疗剂量和疗程以及如何与其他药物联合应用等，有待未来进一步深入研究。