错配修复蛋白和p53蛋白在结直肠癌中的表达及其临床意义

刘菊林 李 静 陈 军 卢国丰 王红霞 杨 荣

上海健康医学院附属嘉定区中心医院病理科(201800)

背景：研究表明，结直肠癌的主要发病途径有两条，即染色体不稳定性途径和微卫星不稳定性(MSI)途径。目的：探讨错配修复蛋白(MMRP)和p53蛋白在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化SP法检测2013年1月—2017年12月上海市嘉定区中心医院收治的276例结直肠癌中4种MMRP和p53蛋白表达，并分析其与临床病理特征的关系。分析MSI对结直肠癌患者生存情况的影响。结果：MMRP表达缺失36例(13.0%)，MSI与组织病理学类型、TNM分期和血吸虫感染有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、发病部位、分化程度和淋巴结转移均无关(P>0.05)。p53蛋白在结直肠癌中的阳性表达率为44.9%，其表达与组织病理学类型、TNM分期、淋巴结转移和血吸虫感染有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、发病部位和分化程度均无关(P>0.05)。MSI与p53表达呈负相关(r=-0.169，P<0.05)。MSI组和MSS组的1、3、5年生存率分别为100%、97.2%、83.1%和96.7%、81.9%、38.9%，差异有统计学意义(χ2=12.582，P=0.001)。结论：MSI和p53表达与结直肠癌的临床病理特征关系密切，对肿瘤的恶性程度和预后的判断有指导意义。MSI与p53表达呈负相关，提示两者可能参与结直肠癌不同阶段的发生、发展过程。

全球范围内结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的发病率较高，生存率较低，是严重危害人类健康的疾病之一[1]。近年来我国CRC的发病率呈逐年上升趋势，且趋于年轻化[2]。随着分子检测技术的快速发展，已证实CRC的发病主要有两种途径：一条是以癌基因和抑癌基因为代表的染色体不稳定性途径，如癌基因KRAS、BRAF、PIK3等，以及抑癌基因TP53、APC、DPC4等；另一条是因错配修复基因突变失活或甲基化失活导致的微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)途径，约15%的CRC与MSI相关[3-5]。错配修复蛋白(mismatch repair protein, MMRP)(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)失活将引起DNA错配积聚，导致MSI[6]。在CRC的发病机制中，关于MMRP和p53蛋白表达关系的报道较少见。本研究通过检测CRC患者中MMRP和p53蛋白的表达，并分析其与临床病理特征之间的关系，旨在探究CRC的分子发病机制，从而为临床的精准治疗和预后判断提供理论依据。

材料与方法

一、临床资料

回顾性分析2013年1月—2017年12月上海市嘉定区中心医院存档的276例行手术切除且有完整临床信息和随访资料的CRC标本。其中男性158例，女性118例；平均年龄(64.28±5.69)岁；组织学类型为腺癌206例，黏液腺癌70例；高分化腺癌30例，中分化腺癌166例，低分化腺癌80例。TNM分期(2017版AJCC)Ⅰ+Ⅱ期160例，Ⅲ期+Ⅳ期116例；伴有血吸虫感染者66例。每例标本HE切片均经两位高年资病理医师独立阅片，参照WHO(2010)消化系统肿瘤进行分类。所有病例术前均无化疗、放疗和免疫治疗史。通过门诊、住院复诊和电话方式对纳入患者进行随访，随访截止时间为2019年1月。

二、方法

纳入标本以中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别进行HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色采用SP法。所有抗体、试剂盒和显色剂均为福州迈新生物技术开发有限公司产品。应用3% H2O2去除内源性过氧化物酶活性，高温高压修复抗原，加入即用型MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和p53抗体，DAB显色，苏木素复染。检测过程中设立阳性对照和阴性对照。

结果判断：MMRP在细胞核中呈明确棕黄色判定为阳性，任何比例的肿瘤细胞阳性均视为阳性，与核染色程度以及阳性细胞弥漫或局灶分布无关。细胞核不着色判断为阴性。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一种缺失，判定为MSI，而四种蛋白均表达则判定为微卫星稳定(MSS)。p53蛋白在肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。选择阳性细胞较为集中的区域(热点区)，每个病例选取10个高倍(×400)视野，计数总细胞数，计算阳性细胞比例。阳性细胞比例≥30%为p53表达阳性，<30%为阴性。评判过程由两名高年资病理科医师双盲独立完成。

三、统计学分析

应用SPSS 22.0统计学软件。计数资料的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性分析。生存情况分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MMRP在CRC中的表达

276例CRC患者中，36例(13.0%)MMRP表达缺失，其中MLH1与PMS2共同表达缺失者22例(61.1%)，PMS2单独缺失者2例(5.6%)，MSH2与MSH6共同表达缺失者10例(27.8%)，MSH6单独缺失者2例(5.6%)(图1)。

二、MSI与CRC临床病理特征的关系

MSI与CRC患者组织病理学类型、TNM分期和血吸虫感染有关，差异有统计学意义(P<0.05)；而与患者性别、年龄、发病部位、分化程度和淋巴结转移均无关(P>0.05；表1)。

三、p53蛋白在CRC中的表达

276例CRC患者中，p53蛋白阳性表达124例，阳性率为44.9%(图1)。

四、p53蛋白表达与CRC临床病理特征的关系

p53蛋白表达与CRC患者组织学病理类型、TNM分期、淋巴结转移和血吸虫感染有关，差异有统计学意义(P<0.05)；而与患者性别、年龄、发病部位、分化程度均无关(P>0.05；表1)。

A：MMRP表达阳性；B：MMRP表达阴性；C：p53表达阳性；D：p53表达阴性

表1 MSI和p53表达与CRC临床病理特征的关系n(%)

五、MSI与p53相关性分析

Spearman相关性分析显示，MSI与p53表达呈负相关(r=-0.169，P<0.05)。

六、MSI与患者预后的关系

MSI组和MSS组的1、3、5年生存率分别为100%、97.2%、83.1%和96.7%、81.9%、38.9%，组间相比差异有统计学意义(χ2=12.582，P=0.001；图2)。

图2 MSI组和MSS组的生存函数曲线比较(Kaplan-Meier法)

讨 论

CRC在西方国家的发病率高，仅次于肺癌[7]。随着生活水平的提高以及生活方式的西化，我国CRC的发病率已位居消化道癌症的第二位。CRC发病隐匿，多数患者发现时已处于晚期，虽然目前有各种治疗手段综合应用于CRC，但其5年生存率和总生存率仍较低，探讨其可能的分子发病机制仍是非常重要的课题。目前普遍认为CRC的发生遵循着正常上皮-腺瘤上皮内瘤变-癌的分子演变过程，但越来越多的研究发现DNA错配修复缺陷及其导致的MSI为一条重要的替代性通道[8]。MSI是由DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，常由错配修复功能缺陷引起。正常人体内，DNA错配修复对维持超时遗传信息的完整性是非常必要的，在DNA复制过程中出现碱基错配时，MMRP识别并予以修复，以保证基因组稳定性。如MMRP中的任意一种基因发生突变或甲基化失活，将引起错配修复功能缺失，基因组不稳定，可能使某些癌基因高表达或抑癌基因失表达，继而形成肿瘤[9]。本研究发现，276例CRC患者中的MSI发生率为13.0%，与国内外研究[10-11]结果相近。本课题组还发现，在4种错配修复基因中，MLH1常与PMS2共同缺失，MSH2常与MSH6共同缺失，与以往研究[12]结果相似。

本研究发现，MSI更常见于黏液腺癌中，这与国外研究[10]结果相近。多数黏液腺癌属于低分化腺癌，预后差，但部分黏液腺癌的发病机制可能为MSI途径，其预后更好。故有待于进一步研究来探讨具体的机制。在伴有血吸虫病的CRC患者中，MSI的发生率更高，这与以往的研究[13]结果相似。本课题组的前期研究[14]结果表明，伴有血吸虫病的CRC患者中黏液腺癌所占比例高于无血吸虫病的CRC患者。而MSI更常见于黏液腺癌中，推测这可能是其发生率高的原因之一。有研究指出，伴有MSI的CRC患者临床病理特征包括肿瘤常见于结肠近端、肿瘤分期为Ⅱ期、分化差以及黏液腺癌等[15-16]。本研究中，MSI与CRC患者组织病理学类型、TNM分期和血吸虫感染有关，差异均有统计学意义(P<0.05)；而与患者性别、年龄、发病部位、分化程度和淋巴结转移均无关(P>0.05)。

p53基因是目前研究最多的抑癌基因之一[17]，分为野生型和突变型，其突变或缺失可导致多种肿瘤的发生。p53在CRC中的阳性率为40%～75%，与肿瘤分化、浸润程度和淋巴结转移有关[18]。本研究发现，p53在CRC中的表达阳性率为44.9%，且与TNM分期、淋巴结转移相关。在从腺瘤上皮内瘤变到癌变的过程中，p53抑癌基因突变通常是一个晚期事件，预示着更差的预后。此外，伴有血吸虫感染患者的p53阳性表达率明显高于无感染患者，这与Zalata等[19]的研究结果一致。

有研究[20]发现，MSI CRC中p53基因的总突变率和点突变率分别为53.3%和32.5%。本研究中，MSI患者的p53蛋白阳性表达率为66.7%，且MSI与p53表达呈负相关。提示在CRC发病机制中，MSI和p53基因突变可能是两条不同的通路，在肿瘤的不同阶段发挥作用。另有研究[21]显示p53、MSI与CRC患者预后密切相关，p53突变者的预后较差，而MSI途径的CRC尽管分化程度低，但其预后优于p53基因突变等染色体不稳定性途径的CRC，其具体机制目前尚未完全阐明。且MSI CRC患者对5-FU为基础的辅助化疗不敏感，因此联合检测p53与MSI可对患者预后进行评估，同时为临床合理用药提供依据。

总之，MSI和p53与CRC的临床病理特征关系密切，对肿瘤恶性程度以及预后的判断有指导意义。MSI与p53表达呈负相关，提示两者可能参与CRC不同阶段的发生、发展过程。但研究结论仍需行进一步研究证实。