黄连素对博来霉素诱导肺泡上皮细胞形态及TGF-β1分泌水平的影响

皮玉琪，程立，胡先平

1锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地，湖北十堰442000；2湖北医药学院附属国药东风总医院

肺纤维化是由于过多的成纤维细胞聚集和细胞外基质(ECM)成分如胶原蛋白沉积而导致正常的肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病。肺纤维化主要累及肺间质、肺泡和(或)细支气管，表现为毛细血管内皮细胞与急性弥散性肺泡上皮细胞损伤，最终可导致呼吸衰竭，病死率为50%～70%[1,2]。近年来，肺纤维化的发病率呈上升趋势，临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此，寻找对肺纤维化有效的治疗药物已成为当前医学的迫切需要。黄连素又称小檗碱，是从黄连等植物中提取的活性生物碱。许多研究表明，黄连素具有保护心肌细胞、抗血小板凝集、减少血栓形成、修复内皮细胞、改善血管功能以及抗焦虑、镇静、降糖、降血脂、抗氧化自由基等作用[3，4]，除此之外，国内多项研究表明，黄连素可通过多种途径抗心脏、肝脏、肾脏等多脏器纤维化进程[5～8]。目前对黄连素在肺间质纤维化进展中的作用研究多为大鼠实验，关于黄连素对人肺泡上皮细胞的抗肺纤维化作用机制，以及黄连素抗博来霉素诱导肺间质纤维化的作用和机制，目前也尚未明确。博来霉素已临床应用30余年，抗癌活性强，同时无明显的骨髓功能和免疫功能抑制，但主要不良反应为肺纤维化，因此常被用于各种肺纤维化模型的诱导[9]。2018年8月～2019年2月，本研究以人肺泡上皮细胞A549作为研究对象，通过博来霉素诱导肺纤维化模型，观察不同浓度黄连素处理A549细胞后细胞形态和转化生长因子β1(TGF-β1)分泌水平的变化，初步探讨黄连素抗肺纤维化的作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 A549细胞[10]购于中国科学院干细胞库，接种于含10% FBS的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养，1～2 d换液1次，细胞密度达80%时，用含0.25% EDTA-Na2胰酶消化，传代。黄连素、MTT试剂购自Sigma公司，博来霉素购自浙江海正公司，人TGF-β1ELISA试剂盒购自欣博盛公司，FBS购自BI公司，DMEM/F12购自Gibco公司，DMSO购自MP公司。细胞保温箱(Thermo公司)，全波段酶标仪(型号MQX-200)，倒置显微镜(OLYMPUS CKX41)。

1.2 博来霉素作用浓度筛选 消化对数生长期A549细胞，用不含FBS的DMEM/F12培养基处理成细胞悬液(排除FBS对细胞增殖的影响)，按5×104/mL、各取200 μL细胞悬液接种于96孔板，培养24 h后铺满孔底。将博来霉素溶解于PBS中，设置实验组、对照组和空白组。实验组分为6个亚组，分别加入含4、6、8、10、12.5、25 μg/mL博来霉素的DMEM/F12无血清培养基；对照组细胞在无血清培养基中培养，仅加PBS；空白组只有培养基和PBS，不含细胞。每组设置6个复孔。培养24、48 h后每孔加入MTT 20 μL继续孵育4 h，吸弃上清，加入150 μL的DMSO，充分震荡混匀15 min后用全波段酶标仪检测各孔490 nm处光密度(OD)值，取均值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。结果显示，博来霉素能够显著抑制A549细胞增殖，8、10、12.5、25 μg/mL博来霉素作用24、48 h后细胞增殖抑制率高于4 μg/mL浓度(P均<0.05)。其中，10 μg/mL博来霉素作用24 h时，细胞增殖抑制率在50%左右，选取此作用浓度用于肺纤维化诱导实验。详见表1。

表1 不同浓度博来霉素作用不同时间后A549细胞增殖抑制率比较

注：与同时点4 μg/mL浓度相比，*P<0.05。

1.3 细胞分组及黄连素给药方法 将黄连素粉末溶解于DMSO中配制黄连素溶液，博来霉素溶于PBS中配制博来霉素溶液。将A549细胞分为博来霉素组、黄连素1组、黄连素2组、黄连素3组、黄连素4组、DMSO组、培养基组。博来霉素组加入10 μg/mL博来霉素，黄连素1、2、3、4组分别加入60、80、100、125 μmol/L黄连素和10 μg/mL博来霉素混合溶液，DMSO组加入DMSO，培养基组加入不含FBS的DMEM/F12培养基。

1.4 细胞形态观察 分别于处理24、48 h后经倒置显微镜观察各组细胞形态并拍摄照片。

1.5 细胞上清液TGF-β1检测 分别于处理24、48 h后，取各组细胞培养液离心，取上清液分装于1.5 mL的EP管在-20 ℃保存。采用ELISA法检测TGF-β1，每组设置3个复孔，重复3次。根据ELISA试剂盒说明书操作。在空白孔中加入标准品和标本通用稀释液，其余相应孔中加标本和不同浓度标准品(100 μL/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育90 min后洗板5次，在空白孔加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔)。用新的封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育60 min后洗板5次。在空白孔加酶结合物稀释液，其余各孔加入酶结合物工作液(100 μL/孔)。用新的封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育30 min后洗板5次。加入显色底物TMB(100 μL/孔)，避光37 ℃孵箱孵育15 min后加入终止液(100 μL/孔)，混匀后即刻用全波段酶标仪测量OD450值，根据结果制作标准曲线和标准浓度公式，并将各孔OD值带入公式得出各组细胞上清液的TGF-β1浓度。

2 结果

2.1 各组细胞形态 培养基组培养24、48 h细胞呈三角形、铺路石、鹅卵石样，细胞大小均匀，排列紧密，无突触及多角，胞内细胞质均匀透亮，细胞间无明显间隙(图1)。博来霉素组A549细胞培养24、48 h后细胞变小，细胞呈现梭形、纺锤形、扁大多形性，边缘不规则，多有触角，胞内细胞质不均匀，细胞间隙增加，处理48 h后变化更加明显(图2)。DMSO组培养24、48 h后细胞逐渐变大，可见较多大圆形细胞，细胞间隙增大，细胞核增大、高亮，胞质变少且不均匀(图3)。黄连素1、2、3、4组培养24、48 h后细胞状态与原始A549细胞相比均有不同程度改变，细胞逐渐趋向多角形、扁大形，但均较博来霉素组更加趋向于正常细胞，其中黄连素4组培养24 h细胞形态最趋向正常细胞(图4～7)。

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图1 培养基组培养24、48 h细胞形态

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图2 博来霉素组培养24、48 h细胞形态

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图3 DMSO组培养24、48 h细胞形态

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图4 黄连素1组培养24、48 h细胞形态

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图5 黄连素2组培养24、48 h细胞形态

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图6 黄连素3组培养24、48 h细胞形态

2.2 各组细胞上清液中TGF-β1水平 博来霉素组、DMSO组培养24、48 h细胞上清液TGF-β1水平均高于培养基组(P均<0.05)。黄连素1、2、3、4组培养24、48 h细胞上清液TGF-β1水平均低于博来霉素组(P均<0.05)。黄连素3、4组培养24、48 h细胞上清液中TGF-β1水平低于黄连素1、2组(P均<0.05)。详见表2。

注：A为培养24 h细胞形态；B为培养48 h细胞形态。

图7 黄连素4组培养24、48 h细胞形态

表2 各组培养24、48 h细胞上清液TGF-β1水平比较

注：与培养基组相比，*P<0.05；与博来霉素组相比，#P<0.05；与黄连素1、2组相比，△P<0.05。

3 讨论

肺纤维化的机制目前仍不十分明确，以往认为炎症是导致肺纤维化的首要条件之一，近些年来大量研究报道，在特发性肺纤维化和间质性肺炎中，炎症反应不一定是必要条件，而肺泡上皮-间充质转化(EMT)及相关信号转导通路在诱导肺纤维化中的作用逐渐得到认可[11]。

成年人肺中存在两种肺泡上皮细胞，分别为Ⅰ型肺泡上皮细胞(AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC-Ⅱ)。AEC-Ⅰ为终末分化的细胞，覆盖90%的肺泡表面；AEC-Ⅱ产生、分泌表面活性剂来维持肺泡张力，调节肺泡液平衡，并且在细胞凋亡或受到损伤时分化成AEC-Ⅰ来修复受损屏障[12]。修复过程中可能出现ECM的异样沉积。ECM是细胞外分泌大分子的复杂网络，例如胶原蛋白、酶和糖蛋白，其主要功能包括结构支架和细胞、组织的生化支持。ECM的稳态对于器官发育至关重要，ECM持续异样沉积或失调会导致病理修复，进一步导致EMT[13]。

EMT是肺纤维化的关键过程，而肺泡上皮细胞作为哨兵和效应系统在EMT的过程中起着关键作用。在EMT的过程中有许多通路和细胞因子参与，如TGF-β信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、MAPK信号通路及NF-κB信号通路[14，15]。其中至关重要的细胞因子是TGF-β，TGF-β是一种多效性的细胞因子，可由多种细胞产生，调节细胞增殖、分化、迁移、黏附，调节ECM的代谢，参与肺胚胎发育、组织损伤和修复[16，17]。TGF-β有三种亚型即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1亚型与肺纤维化发生发展关系最为密切[18]。因此，减少TGF-β1的表达可能延缓肺纤维化进程[19]。

正常人肺泡上皮细胞常表现为鹅卵石、类方形等，细胞光滑无明显突触，连接紧密。而肺纤维化细胞常表现为纺锤形、长梭形、多形性伴有多触角。本实验通过博来霉素诱导24 h后的A549细胞有纤维化特点，可认为博来霉素诱导了肺泡上皮细胞纤维化。通过检测各组细胞上清液中TGF-β1水平，我们发现，博来霉素组、DMSO组培养24、48 h细胞上清液TGF-β1水平均高于培养基组，证实了博来霉素具有诱导A549细胞纤维化的作用。DMSO是一种良好的溶剂，本实验中黄连素必须溶于DMSO才可获得均匀、溶解度好的溶液，博来霉素溶于PBS即可。PBS对细胞无损坏作用，但DMSO对细胞具有毒性作用。因此，我们设计了DMSO组用来排除不同溶剂溶解两种药物造成的误差。DMSO组细胞上清液TGF-β1水平高于所有黄连素组，进一步表明黄连素可以降低DMSO对细胞的损伤。但DMSO组细胞形态与博来霉素诱导的肺纤维化细胞有所区别，其光镜下细胞形态变化类似于一种病理性死亡的变化。

一项研究显示，低浓度的TGF-β1可增加心脏成纤维细胞的活力，促进胶原Ⅲ的合成，而黄连素可呈浓度依赖性地抑制心脏成纤维细胞的活力，降低胶原Ⅲ的合成，促进p38-MAPK蛋白磷酸化[5]。孙斯凡等[6]研究证实，黄连素可减少大鼠肾皮质的TGF-β1、TβRI表达，上调smad7和IκBα的表达，从而减轻肾脏炎症及纤维化。黄连素还能通过减少S1P2受体表达，抑制S1P2-MAPK(主要是ERK1/2和p38-MAPK)通路介导的纤维连接蛋白表达，发挥抗糖尿病肾纤维化的作用[20]。结合以上研究可知，黄连素可以通过多种信号途径抗脏器纤维化，这些信号途径也可能出现在肺组织中。

本研究结果显示，黄连素药物组细胞形态更加趋向于原始的铺路石样形态，且高浓度黄连素组细胞形态稳定性更好；黄连素1、2、3、4组培养24、48 h细胞上清液TGF-β1水平均低于博来霉素组，黄连素3、4组培养24、48 h细胞上清液中TGF-β1水平低于黄连素1、2组，这表明黄连素能够抑制博来霉素诱导的A549细胞形态向多触角形细胞改变，减少TGF-β1的分泌，并且随着黄连素浓度增高、这种作用更加明显，黄连素可能通过下调TGF-β1水平而达到抗肺纤维化的作用。

总之，本研究表明，黄连素可降低博来霉素诱导的A549细胞TGF-β1的分泌水平，并且黄连素浓度越高，保护细胞、延缓细胞纤维化的作用越强。我们认为，黄连素有望成为治疗肺纤维化的新药物。