基于科研成果的药理学教学实验探索

2020-04-28史劲松

实验室研究与探索 2020年1期

蒋敏,李会,史劲松

(江南大学药学院，江苏无锡 214000)

0 引言

药理学实验是药学专业实验课的重要组成部分，其旨在培养学生动手、观察和解决问题的能力[1]。目前单一的验证性实验依旧是各校采用的一种教学模式，这一传统模式并不利于培养创新性应用型药学人才，与我国医药事业快速发展的需求不相匹配，因此，各大院校均致力于大力增加设计性实验课程占比，将传统的验证性实验转变为设计性实验，旨在调动学生学习积极性，提高应用知识、分析解决问题的能力[2]。

随着人们生活水平的日益提高，酒精性肝损伤已成为世界各国共同面临的健康问题，因此研制出能够预防和治疗急性酒精性肝损伤的解酒食品、药品有着重要的临床意义。我校制药工程专业拥有一支高水平的师资队伍和优良的硬件条件，近些年积极开展药理学实验教学改革，推进设计性实验教学工作。本设计性实验依托于学院科研成果，选择与生活实际密切相关的解酒保肝为切入点，建立小鼠中、高剂量饮酒模型，对前期研究成果-文蛤酶解反应深加工产品进行评价，通过实验学生一方面可直接从小鼠的行为学观察到解酒效果，还可通过生化、组织病理学等检测手段从技术角度辅证解酒保肝效果。本综合性实验由学生自由建组，在老师指导下完成实验设计与方案，小组内分工合作完成任务，以期提高学生的综合处理问题能力。

1 实验原理

文蛤，是我国重要的海洋贝类之一，其肉鲜，营养丰富，富含人体必需的氨基酸、矿物质等，现代药理学研究表明文蛤及其酶解物在抗肿瘤、保肝脏、提高免疫等方面均表现出一定的功效。文蛤酶解产物是本院科研组较为成熟的科研成果，该酶解物整体风味良好，富含具有抗氧化[3-4]、保肝护肝[5]的活性多肽(21.8 g/L)、游离氨基酸(牛磺酸、丙氨酸、谷氨酸等，4.15 g/L)等[6]活性物质，可明显对抗醉酒第二阶段的共济失调现象[7]，延长小鼠在转棒疲劳仪上的停留时间，还能明显延长小鼠醉酒耐受期，缩短小鼠醉酒睡眠时间，同时减少因急性酒精中毒引起的肝脏损伤。

2 试剂及仪器

试剂及溶剂：红星二锅头(56°)，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，一氧化氮(NO)试剂盒均采购于南京建成海浩生物科技有限公司；文蛤酶解产物按照文献[6]中方法制备，即取文蛤肉，加水匀浆，加热至50°C，再依次添加75 u/g中性蛋白酶、75 u/g复合蛋白酶进行二段酶解，酶解温度为45°C，水解3 h，随后加入50 u/g风味蛋白酶，50°C酶解1 h，离心取上清，喷雾干燥，即得。实验前将其配置成0.1 g/mL溶液，待用。

实验动物：昆明种雄性小鼠(体重25～30 g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司),动物饲养温度(23±2)°C，相对湿度(50±5)%，自由进食和饮水。

仪器：转棒仪；全自动生化分析仪；石蜡切片仪；低温高速离心机；紫外分光光度计；电子天平。

3 操作方法

3.1 评价文蛤酶解产物对中剂量饮酒引起小鼠平衡失调的缓减作用

参考文献[8]方法，取20只小鼠，本实验环境下适应喂养1周，禁食12 h后，随机分成2组，每组10只，分别为模型组、实验组，模型组先按照体重灌胃8 mL/kg的生理盐水，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，实验组先按体重灌胃8 mL/kg的文蛤酶解产物，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，记录给药时间、给酒时间。灌胃结束后分别在30、60、90 min时将小鼠放入疲劳仪转棒上，将疲劳仪转速设置为20 r/min，记录小鼠在棒停留时间。

3.2 评价文蛤酶解产物对高剂量饮酒引起小鼠急性肝损伤的保护作用

3.2.1 实验分组与给药

取30只小鼠，本实验环境下适应喂养1周，随机分成3组，每组各10只，分别为正常组、模型组和实验组，取模型组和实验组两组小鼠按照以下方法灌胃：模型组：8 mL/kg的生理盐水，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒；实验组：灌胃8 mL/kg的文蛤酶解产物，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒，记录时间。

3.2.2 翻正反射观察

灌服白酒后随机观察小鼠活动情况。以小鼠爬行不稳、闭眼懒动、后腹拖地为醉酒指标，以行动灵活、精神恢复为醒酒指标，记录小鼠醉酒时间和醒酒时间，计算小鼠醉酒潜伏期(从灌酒至醉酒的时间)和醉酒持续时间(从醉酒至醒酒的时间)[9-10]。

3.2.3 生化指标检测与病理学观察

参照文献[11]方法，末次给酒12 h后取正常组、模型组和实验组3组小鼠摘眼球取血，断脊椎处死小鼠。血液离心(4 000 r/min)后分离血清，全自动生化分析仪检测ALT 与AST水平。

摘取肝脏，取肝脏同一部位，生理盐水反复冲洗，滤纸吸干后，准确称取组织重量，按重量体积比1∶9的比例加入生理盐水，制成10%(w/v)的组织匀浆，低温离心10 min(3 000 r/min)，取上清液按照试剂盒操作说明检测SOD、MDA、NO。同时取肝脏固定部位组织存放于10%中性福尔马林液中固定24 h后转移至75%乙醇，脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察病理学变化。

3.2.4 数据处理

所有数据均采用mean±SD表示。所有数据采用GraphPad Prism 5统计软件进行One-way ANOVA分析，组间比较用t-test法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

4 实验结果

4.1 文蛤酶解产物对中剂量饮酒引起小鼠平衡失调的缓减作用

不同组小鼠在疲劳仪上的停留时间如图1所示。由该图可见，在30、60、90 min时模型组小鼠在转棒上的停留时间均在4 s以内，且不随时间的延长而变化，说明在90 min内小鼠仍旧处于醉酒状态。而与模型组相比，实验组小鼠在疲劳仪上的停留时间明显延长，并且随着时间的延长而显著增加，当90 min时，实验组的小鼠的停留时间是模型的4倍。实验结果提示文蛤酶解产物能显著缓解酒精引起的小鼠运动失调。

图1 不同组小鼠疲劳仪停留时间(*：p<0.05)

4.2 文蛤酶解产物对高剂量饮酒引起小鼠急性肝损伤的保护作用

4.2.1 醉酒潜伏期和醉酒持续时间

不同组小鼠饮酒后醉酒潜伏期与醉酒持续时间如图2所示。由图可见，模型组小鼠醉酒潜伏期为20 min，而实验组小鼠的潜伏期是模型组小鼠的两倍，显著高于模型组(p<0.05)。模型组小鼠的醉酒持续时间长达160 min，而实验组小鼠醉酒时间是模型组的63%，显著低于模型组(p<0.05)。结果提示，文蛤酶解产物具有显著的防醉解酒效果。

图2 不同组小鼠醉酒潜伏期和醉酒持续时间(*：p<0.05)

4.2.2 血液指标

ALT、AST是医学临床上常用用的评价肝脏功能的两个重要肝功能酶。正常情况下，血清中ALT与AST含量极少，当肝脏组织受损导致肝细胞遭到大量破坏后，肝细胞中的ALT、AST释放入血清，导致血清中ALT、AST活性明显增强[12]。

不同组小鼠血清中AST与ALT检测结果如表1所示。与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中ALT、AST明显升高(p<0.05)，说明高剂量饮酒会直接造成肝细胞受损，这与文献报道相一致[13]。实验组小鼠的ALT以及AST与模型组相比均显著下降，说明文蛤酶解产物能够预防酒精对肝脏组织的损伤(p<0.05)。

表1 不同组小鼠血清中AST与ALT的比较

注：a表示与正常组有显著性差异；b表示与模型组有显著性差异，p<0.05

4.2.3 肝脏组织指标

酒精经肠道吸收后，在肝脏经乙醇脱氢酶和非乙醇脱氢酶系统代谢后形成大量自由基和MDA等一系列脂质氧化代谢物。SOD是肝脏中一种重要的抗氧化酶，能清除自由基和过氧化物，防止对细胞和机体的损伤[14]。因此，肝脏损伤越严重，肝组织中MDA含量就越高，SOD水平下降就越明显。与先前研究结果相一致[15]，在酒精性肝损伤模型小鼠中，MDA含量显著高于正常组(p<0.05)，SOD水平显著降低(p<0.05)(见表2)，提示在氧化应激状态下，小鼠肝细胞严重受损。而灌服文蛤酶解产物后，MDA水平显著下降(p<0.05)，SOD水平显著提高(p<0.05)，表明文蛤酶解产物对酒精引起的氧化反应具有很强的抑制作用，并能降低自由基积累。

表2 不同组小鼠肝组织匀浆中MDA、SOD、NO含量

注：a表示与正常组相比有显著性差异(p<0.05)；b表示与模型组相比有显著性差异(p<0.05)

正常情况下，NO在肝脏中发挥微循环功能调节信使，在肝脏中含量水平较低，但是在氧化应激状态下，肝脏会应急性持续生成、释放大量NO，而此时产生的大量NO是肝损伤炎症的重要促进因子，对肝脏产生毒性作用，因此NO是肝细胞氧化应激的关键分子之一[16]。结果提示，模型组小鼠NO水平显著高于正常组，而在饮酒前灌服文蛤酶解产物能够抑制NO的生成(p<0.05)，说明文蛤酶解产物能够预防酒精引起的氧化损伤。

4.2.4 肝脏组织病理切片

肝组织切片如图3所示。正常组小鼠肝索排列整齐，肝组织结构正常，而模型组小鼠肝细胞排列紊乱，肝细胞中出现大小不一的脂肪空泡，这与文献[17]报道相一致；实验组小鼠肝细胞排列整齐，肝细胞无明显的脂肪变性。