不同酵母菌株发酵蓝莓酒有机酸的动态变化研究

屈嫒，满都拉，孙子羽，忻胜兵，赵雪妮，袁文艳，陈忠军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

蓝莓，属杜鹃花科越橘亚科多年生落叶或常绿灌木，因果实多为蓝色而得名。其果实为浆果，呈深蓝色、果皮附白霜、近圆形、皮薄籽小，富含花青素和总酚等营养物质，具有极高的营养价值，具有防止神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌的独特功效[1]。普遍来说，蓝莓果实口感偏酸，对酿酒微生物有一定的影响，这也是发酵蓝莓酒的开发生产中存在的主要问题之一[2]。有机酸的组成与含量决定蓝莓果酒的风味和品质[3]，有机酸的含量、发酵过程中的演变与调控是蓝莓酒品质控制的关键因素之一，因此检测蓝莓果酒中有机酸的变化极为重要。

蓝莓酒的独特酿造工艺和原料早造就了蓝莓酒独特的香气特征。蓝莓发酵酿造的果酒挥发性物质十分丰富，包括醇类、酯类、酸类、羟基化合物、酚类、内酯、萜等几大类，它们气味各异，并进一步通过增效、协同、分离和抑制等相互作用使果酒香气呈现多种多样的特点[4-6]。有机酸本身所具有特殊口味与酸味，使得其对果酒风味影响的重要性仅次于酯类。有机酸的存在，不仅可以加速多糖的转化和果胶物质的分解，还能促进果酒的老熟和澄清[7-9]；能与酒精起酯化反应生成酯，使果酒具有酯香；能使果酒具有清凉爽口的风味[10-11]。另外，果酒中的酵母菌自身还能够产生芳香活性化合物，而改善果酒的最后的香气和风味[12]。以往对蓝莓酒风味的研究主要是对成品酒体中的风味物质含量的研究，鲜见对蓝莓酒发酵过程中有机酸和挥发性物质的动态变化的报道[13]。本研究对不同酵母菌发酵蓝莓酒过程中跟踪取样，采用高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC） 法测定不同酵母发酵蓝莓果酒过程中9 种有机酸含量，以及酒精发酵结束后蓝莓果酒中的有机酸类物质，为进一步研究蓝莓酒发酵过程中风味物质的形成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生蓝莓：内蒙古根河野生资源开发公司。

菌株：T1、FK3-2、GF3 均从根河的野生蓝莓基地的蓝莓果皮获取，T1 为实验室筛选改良的耐高糖酿酒酵母菌株；FK3-2 为实验室筛选改良的耐酸酿酒酵母；GF3 为实验室筛选改良的耐高酒精酿酒酵母。

柠檬酸、柠檬酸钠（食品级）、焦亚硫酸钾、白砂糖（市售）、甲醇（色谱纯）、草酸、酒石酸、D-苹果酸、L-苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸混合标准溶液（2.0 mg/mL）；草酸、酒石酸、DL-苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸（分析纯）：百灵威科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

FA2104N 电子分析天平：北京海天友诚科技有限公司；G7129A 液相色谱分析仪：Agilent Technologies Singapore；PHS-3C pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PO-100/PO-1000 单道移液枪：梅特勒-托利多上海仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

冷冻蓝莓果→筛选→解冻→称量→榨汁→酶解（加果胶酶）→调节成分（加偏重亚硫酸钾、糖，调节pH值）→接种→主发酵→倒罐→后发酵→陈酿→澄清→成品

1.3.2 样品的制备及检测

取适量的冷冻蓝莓果常温解冻，解冻后用榨汁机打碎，经预试验后确定用1∶1（体积比）比例的蒸馏水混匀，按照0.03 g/L 添加果胶酶恒温酶解2 h，酶解完添加120 mg/L 的SO2，调整初始糖量为32.2 BX，调节发酵醪液初始pH 值为3.5，按照7%接种量分别添加活化好的 T1、FK3-2、GF3，在 28 ℃恒温培养箱中发酵28 d 前发酵终止。再将前发酵结束的蓝莓酒倒灌放入20 ℃恒温培养箱中后发酵28 d，然后倒桶低温冷藏陈酿澄清一段时间，最后得到高酒精度的蓝莓酒。在样品前后发酵期间每隔7 d 取一次样，进行成分测定[13-14]。

1.3.3 液相色谱条件

取样品25 mL，加入适量活性炭进行吸附，再使用真空抽滤机进行抽滤，最后用0.22 μm 级滤膜过滤。液相色谱条件：利用C18色谱柱分析9 种有机酸，选择0.08 mol/L 磷酸二氢钾（pH2.9）做流动相，流动相流速为0.30 mL/min，柱温为40 ℃，紫外检测波长为210 nm[15-16]。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中草酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中草酸的含量变化如图1所示。

由图1 可知，T1 酵母菌在前酵期结束阶段草酸含量最高，而后酵过程中草酸有下降趋势，其后酵结束后的酒体中草酸含量比初始发酵醪液中含量高；FK3-2 酵母菌在发酵过程中的草酸含量变化趋势与T1 酵母菌相似，但比T1 酵母菌的含量少；GF3 酵母菌在发酵过程中后酵期14 d 时草酸含量最高，后酵期21 d 时含量最低，后酵结束时的酒体中草酸含量比发酵醪液中的初始含量高。综上来看，3 种不同酵母后酵结束后都会导致蓝莓酒液中的草酸含量增加，这与包蓉[17]的酒精发酵结束后草酸的含量都会有显著增加的研究结论相一致。

图1 蓝莓果酒发酵过程中草酸含量的变化Fig.1 Changes in oxalic acid content during fermentation of blueberry wine

2.2 发酵过程中酒石酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中酒石酸的含量变化如图2所示。

图2 蓝莓果酒发酵过程中酒石酸含量的变化Fig.2 Changes of tartaric acid content during fermentation of blueberry wine

从图2 可知，T1 与FK3-2 酵母菌发酵过程中酒石酸的含量变化趋势大体一致。在前酵期28 d 酒石酸含量有明显差别，GF3 酵母菌发酵过程中酒石酸的含量变化较前两者都大，后酵结束后酒体中的酒石酸含量远远高于初始发酵醪液中的酒石酸含量。综合来看，后酵结束，酒石酸的含量都有所增高，这与包蓉[17]的酒精发酵结束后酒石酸的含量都会有显著增加的研究结论相一致，且GF3 酒体中的酒石酸含量增高的比较显著。

2.3 发酵过程中苹果酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中苹果酸的含量变化如图3所示。

如图3 所示，T1 酵母菌发酵过程中苹果酸的含量变化趋势最大，在前发酵期14 d 时含量最高，后酵期7 d 时含量最低；FK3-2 酵母菌发酵过程中苹果酸的含量变化较稳定，在前酵期28 d 时苹果酸的含量最低，后酵结束后，苹果酸的含量与初始醪液相比有所下降；GF3 酵母发酵过程中苹果酸的含量明显增高，但在后酵结束后苹果酸的含量与初始醪液相比也有所下降；综上来看，3 株菌在发酵过程中苹果酸含量变化趋势各有不同，但在后酵结束后苹果酸的含量都比发酵醪液中初始苹果酸含量低，这可能是由于发酵过程中酵母菌具有代谢产生苹果酸的功能[18]。

图3 蓝莓果酒发酵过程中苹果酸含量的变化Fig.3 Changes of malic acid content during the fermentation of blueberry wine

2.4 发酵过程中α-酮戊二酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中α-酮戊二酸的含量变化如图4 所示。

图4 蓝莓果酒发酵过程中α-酮戊二酸含量的变化Fig.4 Changes of α-ketoglutaric acid content during fermentation of blueberry wine

如图4所示，T1、FK3-2、GF3 酵母菌发酵过程中α-酮戊二酸的含量变化趋势走向基本一致。其中GF3酵母菌发酵过程中α-酮戊二酸的含量最高，后酵结束后，GF3 酵母菌发酵的酒体中α-酮戊二酸的含量最高，其次是T1、FK3-2 含量较低；蓝莓酒发酵过程中α-酮戊二酸的含量的增加可以为果酒提供有机酸的丰富性，并为果酒具有很强的抗氧化能力奠定基础[19]。

2.5 发酵过程中乳酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中乳酸的含量变化如图5所示。

图5 蓝莓果酒发酵过程中乳酸含量的变化Fig.5 Changes in lactic acid content during fermentation of blueberry wine

如图5 所示，T1 酵母菌发酵过程中乳酸的含量最少，其次是FK3-2 酵母菌发酵过程中乳酸含量居中，GF3 酵母菌发酵过程中乳酸含量最高；后酵结束后，T1、FK3-2 酵母菌发酵的酒体中乳酸的含量与发酵醪液中初始的乳酸含量相比有少量增长，GF3 酵母菌发酵的酒体中乳酸的含量与发酵醪液中初始的乳酸含量相比显著增高。综上来看，整个发酵过程中乳酸的含量变化趋于增长的趋势，这说明了乳酸是果酒发酵中波动较大的有机酸[20]。

2.6 发酵过程中乙酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中乙酸的含量变化如图6所示。

图6 蓝莓果酒发酵过程中乙酸含量的变化Fig.6 Changes in acetic acid content during fermentation of blueberry wine

如图6 所示，T1 酵母菌发酵过程中乙酸的含量变化趋势波动最显著。在前酵期14 d 时达到最高，比两者酵母菌同阶段的乙酸含量均高出很多；FK3-2、GF3酵母菌发酵过程中乙酸的含量变化趋势大径相同；后酵结束后，GF3 酵母菌发酵的酒体中乙酸含量最高，其他两株菌的乙酸含量几乎相同。由以上结果来看，不同酵母菌发酵过程中的乙酸的含量变化趋势不同。由于乙酸是果酒中具有挥发性的有机酸之一，过量的乙酸必然造成成品酒挥发酸值超标。不同酿酒酵母产乙酸的能力差异较大，因此发酵过程中所选用的酵母也是影响蓝莓果酒中乙酸含量高低的一个重要因素[21]。而酵母产乙酸的能力还与发酵原料中糖的浓度密切相关，糖浓度越高，酵母发酵产生的乙酸的含量就越高。因此，对蓝莓果酒而言，选择较低的糖浓度进行发酵，可能更有利于其产品的质量。即使蓝莓果酒酵母能够产生一些乙酸，其产生水平也不会超过法规的限量[22]。乙酸物质是酿酒酵母在生长与繁殖过程所产生的次生代谢产物，乙酸次生代谢产物的含量是评定果酒优良品质的重要指标[21]。

2.7 发酵过程中柠檬酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中柠檬酸的含量变化如图7所示。

图7 蓝莓果酒发酵过程中柠檬酸含量的变化Fig.7 Changes in citric acid content during fermentation of blueberry wine

从图7 可以看出，T1 酵母菌发酵过程中柠檬酸的含量变化趋势波动较小，FK3-2、GF3 发酵过程中柠檬酸的含量变化趋势基本一致，在前酵期先大幅度增高再迅速降低，前酵期7 d 时GF3 酵母菌的发酵醪液中柠檬酸的含量明显高于其它菌株；后酵结束后，3 种酵母菌发酵的酒体中的柠檬酸含量几乎一样，比初始发酵醪液中含量高将近一倍左右。据报道适当浓度的柠檬酸可以提高蓝莓果酒中花青素的稳定性，其主要表现在以下两方面：一方面是柠檬酸降低体系pH 值，使花青素处于稳定的阳离子状态；另一方面柠檬酸与花青素中羟基发生酰化反应，降低其反应活性，提高蓝莓酒的稳定性和抗氧化活性[22]，且对果酒酸味起较大贡献作用，所以后发酵结束后的蓝莓果酒的酸味口感有所提升[23]。

2.8 发酵过程中焦谷氨酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中焦谷氨酸的含量变化如图8 所示。

如图8 所示，T1、FK3-2 酵母菌发酵过程中焦谷氨酸的含量变化趋势大体上基本一致，GF3 酵母菌焦谷氨酸的含量变化波动幅度较大，前发酵期28 d 时含量最高；后酵结束，三者发酵的酒体中的焦谷氨酸的含量都比初始发酵醪液中降低了很多，其中GF3 发酵的酒体中焦谷氨酸含量略高，而T1、FK3-2 酒体中的焦谷氨酸含量接近0。焦谷氨酸对皮肤有保湿作用，焦谷氨酸可以抑制酪氨酸氧化酶的活性，阻止“类黑素”物质在皮肤中沉积，有美白皮肤的作用，此外，焦谷氨酸还有角质软化作用[24]，由此来看，GF3 酵母菌发酵的蓝莓酒更益于人们饮用。

图8 蓝莓果酒发酵过程中焦谷氨酸含量的变化Fig.8 Changes of pyroglutamic acid content during fermentation of blueberry wine

2.9 发酵过程中琥珀酸的变化

3 种酵母菌发酵过程中琥珀酸的含量变化如图9所示。

图9 蓝莓果酒发酵过程中琥珀酸含量的变化Fig.9 Changes in succinic acid content during fermentation of blueberry wine

如图9 所示，T1 酵母菌发酵过程中琥珀酸的含量变化趋势波动最小，FK3-2 酵母菌发酵过程中琥珀酸的含量变化趋势波动较大，在前酵期7 d 时琥珀酸的含量增长到最高，GF3 酵母菌发酵过程中琥珀酸的含量变化趋势波动最大；后酵结束后，GF3 酵母菌发酵的酒体中的琥珀酸含量最高。总体上来看，后酵结束，琥珀酸的含量增高。这一结果与赵国群[24]等的试验结果一致。酿酒酵母在酒精发酵过程中，代谢消耗了部分草酸，同时产生乳酸和琥珀酸，在葡萄酒的酒精发酵过程中，酵母菌发酵过程中也会产生乳酸和琥珀酸。2.10 发酵过程中有机酸总含量的变化

3 种酵母菌发酵过程中有机酸总含量的变化如图10 所示。

图10 蓝莓酒发酵过程中9 种有机酸总含量的变化Fig.10 Changes in the total content of nine organic acids in the fermentation of blueberry wine

在不同发酵阶段不同酵母菌发酵醪液中的9 种有机酸总含量是有区别的，前酵期7 d 时含量均有增加，但是 T1 含量最低，GF3 含量最高；14 d 时除 T1 有所上升外，其他均大幅度下降；28 d 时3 株菌均达到第二个峰值，且GF3 含量最高；到后酵初期有机酸含量均下降，后酵14 d 时T1 和FK3-2 总酸含量均上升，而GF3继续下降，后酵28 d 时T1 和FK3-2 总酸含量略有下降，均为12 g/L 左右，而GF3 达到较高值，为20.9 g/L。前发酵结束后3 株菌总酸含量均高于初始发酵醪液，其中GF3 最高，其他两株非常接近。后发酵结束后T1和FK3-2 发酵的酒体中总酸含量仍没有差别，而GF3发酵酒体中总酸含量最高，是其他两种的两倍以上，且总酸量低于前发酵酒。总之3 株菌株发酵结束后蓝莓酒体中的9 种有机酸的总含量比初始发酵醪液明显增高。且蓝莓酒体中的主要有机酸含量因酿酒酵母的种类不同而有差别[25]。

3 结论

通过研究在发酵过程中有机酸含量变化发现，不同酵母菌株发酵过程中9 种有机酸的含量有着明显的差异，且发酵各个阶段9 种有机酸总含量变化趋势也有所不同。前发酵结束时，3 株菌发酵的蓝莓酒体中9种有机酸含量均高于初始发酵醪液，其中GF3 最高，T1、FK3-2 非常接近。后发酵结束时，3 株不同菌株酒体中9 种有机酸的含量低于主发酵结束时含量，均高于初始发酵醪液，且T1 和FK3-2 有机酸含量几乎没有差别，而GF3 发酵酒体中有机酸含量最高，3 株菌中GF3 发酵的酒体中9 种有机酸的含量及总含量都较高。检测不同酵母发酵蓝莓酒过程中有机酸含量的变化为选择良好的蓝莓酒发酵酵母奠定了基础。