响应面法优化蓝靛果红树莓复合发酵汁的研究

2020-04-28魏文倩张冰李利强刘羽佳曲敏

食品研究与开发 2020年8期

魏文倩，张冰，李利强，刘羽佳，曲敏

（哈尔滨商业大学食品工程学院黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

蓝靛果忍冬（Loniceraedulis L.），也叫蓝靛果、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等。为忍冬科忍冬属落叶灌木的小型浆果。在我国东北的大、小兴安岭和长白山地区的野生资源储量最大[1]。蓝靛果中富含花青素、鞣花酸和超氧化物歧化酶等多种抗氧化成分，除此之外还包括 VC、VB1、VB2、VP等多种维生素、膳食纤维、矿物质、几种人体必需氨基酸等多种营养成分，被称为“第三代水果”[2-4]。花青素类（anthocyanidins）属于黄酮醇类化合物，在自然界中广泛分布，是花色甙（anthocyanins）水解产生的有颜色的甙元[5]。经检测，蓝靛果中原花青素含量为1.9 g/100 g，原花青素是以黄烷-3-醇为结构单元通过C-C 键聚合而成的化合物。根据原花青素的聚合程度可分为单倍体（monomer）、寡聚体（oligomer）和多聚体（polymer）。目前，已确定花青素有20 多种，包括天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素等。经研究发现，花青素具有良好的抗氧化性能和显著的清除自由基的能力，是一种天然、高效的自由基清除剂，具有预防和治疗心脑血管疾病、抗肿瘤、抑菌等多种药用价值[6-8]。

红树莓（Rubus ideaus L.），为蔷薇科浆果，俗名马林、覆盆子等，果实甜而多汁、气味芳香，富含保健药用活性成分，在世界上享有“黄金水果”的称号。红树莓除了含有糖类、超氧化物歧化酶、氨基酸、有机酸、维生素和矿物质等营养物质外，与蓝靛果一样富含大量的酚类物质，如鞣花酸、花青素、水杨酸等，被誉为“天然阿司匹林”[9-10]，旷慧等[11]通过研究红树莓果渣提取物发现红树莓中原花青素含量为15.28 mg/g，总黄酮含量为3.71 mg/g。

酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等一些有益菌以新鲜果蔬中的糖类、蛋白质、花色苷等为营养物质，通过代谢而进行发酵，将其转化为易于人体吸收的小分子营养物质[12]。在此过程中不仅保留了果蔬中原有的营养成分与香气还会产生新的营养成分，从而使得发酵汁中富含酶类、氨基酸、有机酸、黄酮类等多种营养物质[13-14]。发酵果汁具有很好的自由基清除能力，可以防治自由基引起的疾病，预防、缓解心脑血管疾病，抗衰老等。其中的有益微生物还可促进肠道蠕动，达到通便减肥等功效[15-17]。洪厚胜等[18]以葡萄果渣、糖蜜为原料，利用酵母菌、乳酸菌等多种菌种共同发酵，考察菌种接种量、初始pH 值、糖添加量、超声时间对超氧化物歧化酶活性及活菌数的影响，获得最佳工艺条件为初始pH值5.00，糖添加量8 %，活菌接种量12 %，超声时间60 min，在此最佳工艺条件下超氧化物歧化酶酶活高达660 U/mL。杨志鹏等[19]以海棠果果汁为主要原料，鼠李糖乳杆菌217-3 为发酵菌株，通过氮源添加量、初始pH 值等发酵条件优化，获得最佳发酵条件为乳清蛋白粉添加量为0.5%，发酵前pH 值为7.0，获得的发酵汁酸甜可口、抗氧化性强，多酚含量为573 mg/L，胆固醇降解率为73.4%；林冰等[20]以新鲜刺梨为原料，自然发酵，考察糖添加量、发酵温度及发酵时间对刺梨酵素的影响，获得刺梨酵素的最佳发酵工艺：糖添加量为20 g，温度30 ℃，发酵时间5 d，在此最佳工艺条件下获得的刺梨发酵汁具有较好的清除DPPH 自由基、ABTS 自由基等能力。费鹏等[21]以怀山药为发酵原料，以植物乳杆菌进行发酵，通过单因素和正交试验优化得到怀山药酵素发酵的最佳工艺为糖浓度12%、接种量6%、发酵时间30 h、发酵温度42 ℃，在该条件下怀山药发酵汁超氧化物歧化酶活性为15.35 U/mL。莫大美等[22]以玫瑰为发酵原料，以酵母菌和乳酸菌为菌种，考察了接种量和发酵时间，在双菌种的培养基础上接种醋酸菌进行联合发酵，得到具有淡淡的酒香、味道酸甜、具有玫瑰花色的发酵汁。本研究以蓝靛果、红树莓为原料，采用耐高糖酵母菌为接种菌，以浆果复合发酵汁中原花青素的含量为指标，通过单因素和响应面实验考察浆果配比、酵母接种量、发酵温度、发酵时间的影响，确定了最佳发酵工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果冻果和红树莓冻果：哈尔滨市郭小果农业科技发展有限公司；安琪耐高糖酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（10 000 u/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；超氧化物歧化酶试剂盒：A001-3 南京信帆生物技术有限公司；乙醇（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；DPPH：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB 型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；Z-366 型高速离心机：德国贺默公司；UV-2550 型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱、DHP-9162 型电热恒温培养箱、HWS24 型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；BS210S 型电子天平：德国Sartorius 仪器公司；HNY-100B 型恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；JYL-C93T 九阳料理机：九阳股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 浆果预处理与酶解

将蓝靛果与红树莓冻果于室温20 ℃下解冻，按一定比例分别打浆。将果浆加入到已灭菌的锥形瓶中，按混合果浆的一定比例添加纯净水后，添加2.5%的果胶酶酶解，充分搅拌均匀，室温20 ℃静置1 h ～1.5 h。

1.3.2 菌种的活化

将耐高糖酵母菌粉置于37 ℃无菌水中，室温20 ℃活化 0.5 h～1 h。

1.3.3 蓝靛果-红树莓复合发酵汁制备的单因素试验

称取一定比例的蓝靛果和红树莓酶解果浆40 g置于无菌锥形瓶中，加入已活化的耐高糖酵母，加入10%的白砂糖，加无菌水定容至100 mL。充分混匀，封口膜封口，在27 ℃恒温培养箱中发酵。检测浆果复合发酵汁中原花青素的含量。

1.3.3.1 浆果配比的影响

分别设定蓝靛果和红树莓果浆比例为0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，考察蓝靛果和红树莓原料配比对浆果复合发酵汁中原花青素含量的影响。

1.3.3.2 酵母菌接种量的影响

分别设定酵母接种量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察酵母接种量对浆果复合发酵汁中原花青素含量的影响。

1.3.3.3 发酵温度的影响

将浆果复合发酵汁分别放置于 22、24、26、28、30 ℃的恒温箱中进行发酵，考察发酵温度对浆果复合发酵汁中原花青素含量的影响。

1.3.3.4 发酵时间的影响

将浆果复合发酵汁分别发酵 0、4、8、12、16、20 d，考察发酵时间对浆果复合发酵汁中原花青素含量的影响。

1.3.4 浆果复合发酵汁的响应面实验

选取浆果配比、酵母接种量、发酵温度、发酵时间进行四因素三水平的Box-Behnken 中心组合研究，同时运用Design-Expect 8.0.6 软件对试验数据进行分析，确定最佳发酵工艺参数见表1。

表1 中心组合试验因子及编码值Table 1 Center combination of experimental factor and coding value

1.4 花青素含量的测定

参照李佳桥等[23]的方法进行改进，取50 mL 浆果复合发酵汁样品，以200 目筛过滤后，于8 000 r/min离心15 min，取上清，得到浆果复合发酵汁工作液。在波长为530 nm 下测浆果复合发酵汁的吸光度。

1.5 浆果复合发酵汁的抗氧化性检测

1.5.1 超氧阴离子自由基清除率的测定

参照李斌等[24]方法，采用邻苯三酚自氧化法测定浆果复合发酵汁的超氧阴离子自由基清除率。

1.5.2 DPPH 自由基清除率的测定

参照李杰等[25]的方法并改进，检测浆果复合发酵汁的DPPH 自由基清除率。取50 mL 浆果复合发酵汁样品，以200 目筛过滤后，于8 000 r/min 离心15 min，取上清，得到浆果复合发酵汁工作液。向2 mL 浆果复合发酵汁工作液中加入2 mL 0.10 mmol/L 的DPPH 溶液，混匀，25℃避光反应30 min，于517 nm 波长下测定吸光度。按下式计算DPPH 自由基的清除率（%）。

DPPH 自由基清除率/%={1-（Ai-Aj）/A0}×100

式中：A0为DPPH 溶液和蒸馏水混合液的吸光度；Ai为发酵汁工作液和DPPH 混合液的吸光度；Aj为发酵汁工作液的吸光度。

1.5.3 羟基自由基清除率的测定

参照李杰等[25]的方法检测浆果复合发酵汁对·OH清除作用：取50 mL 浆果复合发酵汁样品，以200 目筛过滤后，于8 000 r/min 离心15 min，取上清，得到浆果复合发酵汁工作液。将1 mL 邻菲咯啉（0.75 mmol/L）、3.8 mL 磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.4）和 1.5 mL Fe2SO（40.75 mmol/L）混匀，后取1 mL 浆果复合发酵汁液和1 mL 0.01%H2O2加入到该混合物中，37 ℃水浴反应60 min，在536 nm 处测吸光值。·OH 清除率通过下式计算：

·OH 清除率/%=（A1－A2）（/A3－A2）×100

式中：A1为样品的吸光值；A2为不加样品的吸光值；A3为不加样品和H2O2的吸光值。

1.6 浆果复合发酵汁酶活力的测定

1.6.1 浆果复合发酵汁超氧化物歧化酶活性的测定

将浆果复合发酵汁进行4 000 r/min 离心10 min后取上清，超氧化物歧化酶活性的测定参照超氧化物歧化酶试剂盒的方法进行测定。

1.6.2 蛋白酶的活力测定

采用GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》，采用福林酚法测定蛋白酶活力；测定浆果复合发酵汁的蛋白酶活力。

2 结果与分析

2.1 浆果比例对浆果复合发酵汁的影响

通过改变蓝靛果与红树莓的比例考察浆果复合发酵汁中花青素含量的变化见图1。

从图1 可以看出，在一定范围内花青素含量随蓝靛果含量的增加呈现先升高后降低的趋势，其中蓝靛果与红树莓的质量比例为3∶1 时花青素含量出现峰值，达到7.4 mg/mL。由于蓝靛果和红树莓中均富含花青素，原花青素含量分别为1.9 g/100 g 和15.28 mg/g，因为相同质量的蓝靛果和红树莓，蓝靛果中花青素含量更多，所以浆果复合发酵汁中花青素含量随着蓝靛果比例的增大而增加。同时，由于底物浓度的提高，会影响花青素在浆果复合发酵汁中的溶解度，可能会使其溶解度降低。战伟伟等[26]以蓝靛果和椰子研制复合酵素发酵工艺发现，随着蓝靛果添加比例的提高，发酵液中的花色苷和黄酮类物质在复合酵素发酵原液中的溶解度不断降低，导致其含量的增加趋势逐渐放缓。这与本研究的结论一致。综上，确定浆果复合发酵汁中蓝靛果和红树莓的最适质量比例为3∶1。

图1 蓝靛果与红树莓比例对浆果复合发酵汁花青素含量的影响Fig.1 Effect of ratio of Bule Hazelnut and red raspberry on anthocyanin content in berry compound fermented juice

2.2 酵母接种量对浆果复合发酵汁的影响

通过改变酵母接种量考察浆果复合发酵汁中花青素含量的变化见图2。

图2 酵母接种量对浆果复合发酵汁花青素含量的影响Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on anthocyanin content in berry compound fermented juice

从图2 可以看出，随着酵母接种量的增加，浆果复合发酵汁中花青素的含量呈现先增加后下降的趋势，当接种量为1.5%时，花青素的含量最高达到8.2 mg/mL。原因是当酵母浓度过低时，酵母生长繁殖速度过慢，发酵液中酵母的数量少，酵母对营养物质的利用率低从而导致发酵速度慢，浆果细胞中花青素溶出过慢，发酵液中花青素含量少。随着酵母接种量的升高，发酵液中酵母数量增多，由于酵母属于兼性厌氧菌，代谢过程中会产生乙醇等有机溶剂，使得浆果细胞中的营养物质不断溶出到发酵液中，从而使得花青素含量升高[27]。但当酵母接种浓度过高时，酵母会过多消耗发酵液中的糖类、蛋白质和维生素等营养物质用于自身过度繁殖，甚至发酵液中营养物质已经不足以用于酵母自身的快速繁殖，从而发酵液中存在大量活着的酵母及其残体。刘学铭等[27]认为，酵母在繁殖过程中，可能会使花青素的糖苷形式发生降解、产生花青素苷元或发生聚合而成为聚合花青素,均会导致水溶性下降而不断沉淀下来。本研究发现酵母的表面会吸附花青素，并且花青素会随着酵母的残体而沉淀到发酵液底部，且发现酵母的数量越多，发酵液的上清液颜色越浅，可初步判断酵母对花青素具有较强的吸附能力，从而导致发酵液中花青素含量在一定范围内随着酵母接种量的升高而降低，因此酵母接种量过高不利于发酵。综上，确定浆果复合发酵汁的酵母接种量为1.5%。

2.3 温度对浆果复合发酵汁的影响

通过改变发酵温度考察浆果复合发酵汁中花青素含量的变化见图3。

图3 温度对浆果复合发酵汁花青素含量的影响Fig.3 Effect of temperature on anthocyanin content in berry complex fermented juice

从图3 可以看出，随着发酵温度的升高，浆果复合发酵汁中花青素的含量呈现先增加后下降的趋势，当温度为28 ℃时，花青素的含量最高达到7.9 mg/mL。原因可能温度过低，酵母的生长繁殖速度慢，数量少，进而对营养物质的利用率低、发酵速度慢，且温度过低时蓝靛果和红树莓细胞中花青素溶出过慢、溶解度低，导致发酵液中花青素含量少。而随着温度的升高，酵母的繁殖速度加快，在其代谢过程中由于兼性厌氧菌的特性会产生乙醇等有机溶剂，从而促使浆果细胞中的花青素等不断溶出，花青素含量升高。但当温度过高时，酵母繁殖和衰老速度过快，大量酵母的表面对花青素的吸附又导致花青素会随着酵母的残体而沉淀到发酵液底部。同时花青素的不稳定性使其在温度过高时易分解，导致花青素含量在一定范围内随着发酵温度的升高而降低。因此，发酵温度应控制在适宜的范围内[28]。综上，确定浆果复合发酵汁的最适发酵温度为28 ℃。

2.4 发酵时间对浆果复合发酵汁的影响

通过改变发酵时间考察浆果复合发酵汁中花青素含量的变化见图4。

图4 发酵时间对浆果复合发酵汁花青素含量的影响Fig.4 Effect of fermentation time on anthocyanin content in berry compound fermented juice

从图4 可以看出，随着发酵时间的延长，浆果复合发酵汁中花青素的含量呈现先升高后下降的趋势，当发酵在第8 天时，花青素的含量最高达到7.8 mg/mL。可能是随着发酵时间的延长，在果胶酶的缓慢作用下浆果细胞中花青素逐渐溶出，同时酵母代谢中产生的乙醇等有机溶剂又促进了花青素的溶出[29-30]。本研究中，在二者的叠加作用下，加剧了花青素的溶出。但由于花青素分子结构的特殊性，受发酵体系中pH 值、残糖量、酒精度等环境因素的影响较大，因此随着发酵时间的延长，花青素的形态发生一系列变化甚至降解，加上酵母对色素的吸附以及微生物产酶促作用都可能造成前花青素含量下降[30]。本研究中通过观察发酵液的颜色深浅可以得出，随着发酵时间的延长，发酵液的上清液颜色越浅，佐证了花青素的含量逐渐降低。综上，酵素的适宜发酵时间确定为8 d。

2.5 响应面法优化工艺条件结果分析

2.5.1 工艺参数优化

中心试验设计及试验结果见表2。

经过Design-Expect 8.0.6 软件对数据的回归分析，以花青素含量Y 为响应值，得到花青素含量预测值对编码自变量的回归方程为：

花青素含量：Y=8.72+0.62×A-0.25×B+0.071×C+0.064×D+0.26×A×B+0.34×A×C-0.12×A×D-0.18×B×C-0.22×B×D-0.21×C×D-1.15×A2-0.24×B2-0.98×C2-1.19×D2

回归模型的方差分析见表3。

表2 中心试验设计及试验结果Table 2 Center experimental design and experimental results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression models

续表3 回归模型的方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression models

分析表3 可知，因素变量的大部分一次项和二次项对浆果复合发酵汁中花青素含量的影响是高度显著的（P＜0.000 1），部分二次交互项对响应值影响不显著（P＞0.05）。该模型的Adj R2=0.971 2，说明模型能解释97.12%响应值的变化，模型的P 值为＜0.000 1，说明模型的回归极其显著，拟合较好；从回归分析表中得出：A、B、C、D 4 个因素对花青素含量的影响为：蓝靛果与红树莓比例（A）＞酵母菌接种量（B）＞发酵温度（C）＞发酵时间（D）。

2.5.2 浆果复合发酵汁影响因素响应面分析与验证

响应面图形是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图见图5，从响应面分析图上可以找出最佳工艺参数及各工艺参数之间的相互作用。响应面图可以更清晰地反映因素对响应值的影响。

图5 各因素交互作用对浆果发酵汁中花青素含量的影响响应面图Fig.5 Response surface diagram of the effects of various factors on the anthocyanin content in berry compound fermented juice

由图5 可知，响应面均为开口向下，随着每个变量因素的增大，响应值增大，响应值增大到极值后，随着变量因素的增大，响应值减小。响应曲面越陡，说明响应因素对响应值的影响越显著。模型顶点为最佳工艺参数。经Design-Expect8.0.6 软件分析得到最佳发酵工艺条件为温度 28.23 ℃，蓝靛果∶红树莓=3.23∶1（质量比），酵母接种量为1.27%，发酵时间为8.19 d，在此条件下，浆果复合发酵汁的花青素理论含量为8.854 mg/mL。根据实际操作条件对经Design-Expect 8.0.6 软件分析得到的最佳工艺条件进行调整，确定最后验证试验的发酵工艺条件为：温度 28 ℃，蓝靛果∶红树莓=3.23∶1（质量比），酵母接种量为1.27%，发酵时间为8 d。

经过3 次重复试验验证，得到复合发酵汁花青素含量为8.91 mg/mL，与预测值相近，说明优化工艺重复性良好，最优工艺的结果可靠，在此工艺条件下，较初始鲜浆果复合果汁提高了71.35%。