空气等离子体对面包酵母的生物学效应的研究

韩芸娇，肖霄，张彬，张媛媛

（石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035）

空气等离子体属于低温等离子体的范畴，是在活化放电时激发形成的等离子体。放电装置为电火花发射器，它的工作原理是利用高压变压器把220 V 交流电压升高至2 500 V～3 000 V，使发射器两电极间发生火花放电，产生高频电，高频电流馈送至串联的谐振电路中，再经高频变压器升压到180 kV～210 kV，最后在尖端电极上放射出强力火花。在大气压室温环境下，电火花发射器作用于周围的空气，电火花发生器在空气中发射火花弧光（肉眼可见紫色光），产生较为复杂的等离子体[1]。等离子体产生时间短，活性粒子对样品作用后快速消失，使得等离子体具有作用效率高，操作方便，安全无污染等特点，这些特性拓宽了等离子体的应用领域。应用领域主要包括：改变高分子材料表面性质[2]、工业三废的处理[3-4]、微生物灭菌诱变[5-6]等。等离子体形成过程中可以产生紫外线，能量粒子和带电粒子[7]，使其可在医用材料的表面灭菌、菌膜的清理、生化武器的消除等方面发挥作用。

目前，关于等离子体的生物效应的研究集中于细胞膜上的多糖和蛋白质的降解[8]，对细胞膜结构的致命的破坏[9]，并最终致使细胞裂解，内溶物溶出等。本试验从生物学角度研究了空气等离子体对面包酵母的作用效应。酵母是一种真核生物，细胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖两类多糖组成，相较于细菌它的细胞壁更加坚硬。通过生物学效应的研究，为等离子体杀菌[10-12]及后续试验等离子体微生物诱变[13]等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

面包酵母3G-28 实验室保藏；酵母膏（生化试剂）、蛋白胨（生化试剂）、琼脂粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖（分析纯）：西陇化工股份有限公司；吉姆萨染液（分析纯）：北京鼎国生物技术有限责任公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G-250（分析纯）：北京博奥拓达科技有限公司；盐酸（分析纯）、乙醇（分析纯）、磷酸（分析纯）：北京化工厂。

恒温培养箱（DHP-9052）：天津顺诺股份有限公司；摇床（MX-YZ）：金坛市梅香仪器有限公司；超净台（SW-CJ-1Cu）：郑州宏朗有限公司；紫外分光光度计（UV-6100BS）：上海美普达股份有限公司；高温灭菌锅（LX-B100L）：合肥华泰有限公司；电火花发射及检测器：三鱼电气设备有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；3K15 高速冷冻离心机：美国Sigma 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌体的培养

用接种环挑取一环实验室保藏的斜面酵母菌种3G-28，无菌条件下接种于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中[14-17]，置于恒温摇床，30 ℃，150 r/min 培养 36 h，再于 4 ℃冰箱中静置 3 h[18]，离心（3 000 r/min，10 min），无菌水清洗后，稀释，均匀涂布在固体培养基上，放入培养箱中静置，30 ℃培养24 h。挑取平板上单菌落接种于斜面培养基中，30 ℃，培养24 h 后，置于4 ℃冰箱中保存，每月定期传代保存。

1.2.2 空气等离子体处理方式

取适当稀释后的菌液5 mL 置于内径为71 mm 的培养皿中，液体深度为2 mm，将培养皿放置于电火花发射装置下方，调整发射端与液面距离为1 cm，控制空气等离子体处理样品的时间分别为 0、1、2、3、4、5 min（操作过程中肉眼可见紫色光线）。

1.2.3 空气等离子体对面包酵母细胞生长的影响

适当稀释经过空气等离子体作用后的菌悬液，取100 μL 均匀涂布在平板上，30 ℃静置培养24 h，菌落计数并计算不同处理时间后菌液细胞的存活率，每个处理时间做3 组平行试验。

1.2.4 菌液pH 值和温度的测定

用pH 计和温度计测定经空气等离子体处理过的菌悬液的pH 值和温度，每个条件做3 组平行试验。

1.2.5 菌液pH 值对酵母细胞存活率影响的测定

用稀盐酸调节菌液pH 值至3.05（空气等离子体处理5 min 后的pH 值），与未调节pH 值的菌液分别经过适当稀释后，均匀涂布在固体培养基上，30 ℃静置培养24 h，计算菌落数。

1.2.6 细胞染色及生长状态的观察

吉姆萨染液的配制方法：称取1 g 吉姆萨染料，加入66 mL 甘油，混合均匀，置于60 ℃恒温水浴锅中溶解2 h，取出冷却，加入66 mL 甲醇，混合均匀作为吉姆萨原液，使用前将原液用磷酸缓冲盐溶液稀释十倍即可使用。

分别取适量经不同时间处理后的菌液涂于载玻片上，自然风干，用吉姆萨染液染色2 min，无菌水冲去多余染液，置于显微镜下观察细胞染色情况。适当稀释不同时间处理后的菌液，涂布平板，置于30 ℃培养箱中培养并观察酵母菌的生长情况。

1.2.7 面包酵母胞外蛋白含量的测定

将经过不同时间处理的菌悬液离心（3 000 r/min，10 min），取出上清液，测定酵母细胞外蛋白含量，测定方法为考马斯亮蓝法[19-21]。

考马斯亮蓝法是测定微量蛋白浓度时的常用方法，该方法快速灵敏且定量测定。原理是在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合时能够改变染料最大吸收峰的波长，从465 nm 变成595 nm，溶液的颜色发生变化（红色变蓝色），进而测定波长为595 nm 处时光吸收的值，就可以计算求得其结合蛋白质的量。

1.2.7.1 试剂的配制

标准蛋白质溶液：用0.15 mol/L NaCl 溶液配制1 mg/mL 牛血清白蛋白溶液。

考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 乙醇（95%）中，再加入100 mL 磷酸（85%），混和均匀后加入去离子水稀释，至1 000 mL，配好的溶液置于避光处过夜，滤纸过滤后使用。

1.2.7.2 标准曲线的制作

取标准蛋白质溶液 10、20、30、40、50、60 μL 分别置于洁净试管中，加水至1 mL，再加入5 mL 考马斯亮蓝试剂，混和均匀后静置5 min，在波长为595 nm 处测定吸光值，3 组平行试验。

1.2.7.3 样品的测定

取适量待测样品，按1.2.7.2 中方法处理，使测得样品的吸光值在标准曲线的范围内，以求得不同处理时间的胞外蛋白含量。

1.2.8 面包酵母胞外核酸含量的测定

将经过空气等离子体作用不同时间的菌悬液离心（8 000 r/min，10 min），取出上清液，用紫外分光光度计分别测定不同波长下（260 nm 和280 nm）的吸光度值。核苷酸浓度计算公式如下[22]：

核苷酸/（μg/mL）=（11.87A260-10.4A280）×100/9

2 结果和分析

2.1 空气等离子体对面包酵母3G-28细胞生长的影响

量取5 mL 菌液置于电火花发射装置下方，作用不同时间，试验结果如图1 所示。

图1 空气等离子体处理面包酵母3G-28 细胞的存活曲线Fig.1 Survival curve of 3G-28 treated with the air plasma

空气等离子体能够对酵母细胞造成损伤并致其死亡，细胞的存活率随作用时间增加呈下降趋势。3 min时，酵母细胞的存活率为37.355%；4 min 以后存活率下降速率趋于平缓，5 min 时，存活率为29.797%。

2.2 空气等离子体对3G-28酵母菌悬液pH值和温度的影响

空气等离子体对BY-3 酵母菌悬液温度和pH 值的影响见图2。

图2 空气等离子体对3G-28 酵母菌悬液温度和pH 值的影响Fig.2 Effects of the air plasma on temperature and pH value of 3G-28

由图2 可知，空气等离子体的作用能够使菌液的温度和pH 值发生变化。作用5 min 后，菌液温度由25.0 ℃升至31.1 ℃，上升5.1 ℃，此温度范围亦属于酵母3G-28 的生长温度范围。同时，被处理后菌液的pH值随处理时间的延长而降低，2 min 之前，pH 值下降较为明显，随后pH 值降低较为缓慢，5 min 时，由最初的5.25 降低至3.05。

2.3 菌液pH值对酵母3G-28细胞存活率的影响

pH 值对BY-3 细胞存活率的影响见图3。

图3 pH 值对3G-28 细胞存活率的影响Fig.3 Effects of pH on surviving number of 3G-28

由图3 可知，当菌液的pH 值分别为3.05 和5.25时，酵母细胞的存活情况基本一致。说明在等离子体作用过程中，pH 值的下降并不是导致酵母细胞死亡的主要原因。

2.4 空气等离子体面包酵母3G-28细胞染色及生长状态的影响

处理后细胞染色观察见图4。

图4 处理后细胞染色观察Fig.4 Microscopic examination of stained BY-3 cells after the plasma treatment

由图4 所示，细胞的染色包括化学的亲和作用和物理的吸附作用，不同的细胞，细胞内成分不同，通透性也存在差异，这就使得细胞对不同染料所表现出的亲和吸附能力有所不同，染色程度存在差异。试验使用相同的染色方法对空气等离子体作用前后的面包酵母3G-28 的细胞进行染色，在显微镜下观察，发现经空气等离子体作用后细胞染色会加深。处理5 min后的酵母3G-28 的细胞染色程度明显大于处理1 min后的细胞染色程度。表明空气等离子体的作用对酵母的细胞膜结构造成了破坏，使得细胞通透性发生了变化，通透性增加能够使染料进入细胞更加容易。试验中还发现，经空气等离子体作用后，部分细胞呈现出一定的生长延迟现象，生长速度相较于对照组较慢。

2.5 空气等离子体对面包酵母3G-28胞外蛋白的影响

蛋白质标准曲线见图5。

图5 蛋白质标准曲线Fig.5 Standard protein curve for routine protein assay

蛋白质标准曲线如图5 所示，蛋白质浓度在10 μg/mL～60 μg/mL 的范围内时，A595nm与蛋白质浓度的线性关系良好，y=0.008 7x+0.029 1，R2=0.995 0。空气等离子体作用菌液不同时间所求得的面包酵母3G-28 的胞外蛋白含量如图6 所示。

图6 空气等离子体对胞外蛋白含量的影响Fig.6 Change in extracellular protein concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由图6 可知，随作用时间的增加，胞外蛋白含量明显增加，作用2 min 时，胞外蛋白含量增长缓慢，3 min后增速明显加快。作用5 min 时，胞外蛋白含量达到35.21 μg/mL，与未经作用的3G-28 菌液相比，胞外蛋白含量增多了近1.5 倍，变化显著。

2.6 空气等离子体对酵母3G-28细胞胞外核酸的影响

空气等离子体对BY-3 细胞胞外核酸的影响见图7。

图7 空气等离子体对3G-28 细胞胞外核酸的影响Fig.7 Change in extracellular nucleic acid concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由图7 可以看出，随着处理时间的延长，酵母3G-28 的细胞胞外核酸逐渐含量增加，5 min 时胞外核酸含量达到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2倍左右。

3 结论

本试验研究空气等离子体对酵母3G-28 细胞的部分生物学效应的影响，试验发现：

1）在空气等离子体作用下，酵母菌液的温度和pH值均发生变化，作用5min，菌液温度由25.0 ℃升至31.1 ℃，pH 值由 5.25 降低至 3.05，2 min 后，pH 值下降较为缓慢，但温度和pH 值的变化并不影响菌落的生长情况；

2）作用5 min 时，酵母3G-28 细胞的胞外蛋白和核酸含量均增加，胞外蛋白含量为35.21 μg/mL，较初始值增加了1.5 倍，同时胞外核酸含量达到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2 倍左右；酵母3G-28 细胞的存活率随作用时间增加呈下降趋势，5 min 时，存活率为29.797%。

3）显微镜下观察酵母3G-28 的染色细胞，随空气等离子体处理时间增加，染色逐渐加深。

空气等离子体能够对酵母细胞造成损伤并致其死亡，空气等离子在试验过程中可产生活性氧，会在一定程度上对菌体细胞的细胞壁和细胞膜造成破坏，使细胞内溶物溶出，如蛋白质和核苷酸。由此认为，空气等离子体对酵母细胞的直接和间接作用产生的活性氧可能是使得酵母3G-28 细胞损伤和死亡的主要原因。