玉米不同回交世代DH 系遗传分析研究

齐 欣，刘欣芳，马 骏，贾钰莹，刘晓丽，孟庆国，姜 敏*，李思南

（1.辽宁省农业科学院玉米研究所，辽宁沈阳 110161；2.中国人民解放军战略支援部队信息工程大学，河南郑州 450001）

玉米选育新品种的核心环节是选育优良自交系，而与传统选育方法不同，单倍体育种技术可快速、大规模地创制玉米纯系。随着诱导效率不断提高，单倍体育种技术也广泛地应用于育种实践中[1-2]。但目前对单倍体诱导遗传机理的研究多是以F1代诱导加倍形成的DH 群体为研究材料，而不同回交世代DH 系之间的遗传分析报道较少。该研究以“A619Ht3×辽3162”构建回交群体BC1F1和BC5F1，利用高频诱导系辽诱1 号[3]诱导加倍形成2 个回交世代BC1F1和BC5F1的DH 群体，从株高、穗位高、穗长、穗行数、穗粗、行粒数等农艺性状进行分析，结合SSR 分子标记技术，阐明不同回交世代DH 系之间的遗传变异规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DH 群体的获得。以辽宁省农业科学院玉米所选育的辽诱1 号诱导“A619Ht3×辽3162”的回交群体BC1F1和BC5F1产生单倍体，通过自然加倍得到回交群体DH 系各50 个。

1.1.2 SSR 反应体系。采用CTAB 法（2% CTAB，1M Tris-HCl，5M NaCl，0.5M EDTA 混合液）提取亲本及DH 系的总DNA，按照康为世纪2*Es Taq MasterMix配制20 μL PCR 反应体系，Mix 10 μL，Pirmer 2 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。

1.2 方法

1.2.1 田间试验。2 个回交群体的各50 个DH 系和回交亲本于2017 年春种植在辽宁省农业科学院南地试验区，完全随机区组设计，每个DH 系种植1行，行长3 m，每行11 株，每个群体3 次重复。在大喇叭口期取叶片，储存于超低温冰箱，以备提取DNA。田间调查株高、穗位高，室内考察穗长、穗粗、穗行数、行粒数等农艺性状。

1.2.2 SSR 分子标记。选取均匀分布在玉米10 条染色体上的SSR 引物（引物序列从www.maizegdb.org网站获得），由北京赛百盛公司合成总计100 对。利用这些引物对亲本辽A619Ht3 和辽3162 进行多态性筛选，用4%琼脂糖凝胶电泳对PCR 结果进行检测，从中筛选出20 对能清晰分辨出亲本的SSR 引物用于DH 群体的分析。

1.3 统计分析方法

采用SPSS、EXCEL 软件对DH 系的农艺性状进行方差分析、变异系数以及有关统计计算。SSR 结果分析参照Senior 等[4]方法进行。

2 结果与分析

2.1 DH 群体农艺性状方差分析

从表1 可以看出，100 个DH 系在株高、穗位高、穗长、穗行数、穗粗、行粒数等6 个重要性状上的差异均达到极显著水平，说明各性状在回交群体DH系间存在显著差异性。

2.2 不同回交世代DH 群体变异性分析

从表2 可以看出，低回交世代BC1F1所构成的回交群体的穗位高、穗长、穗行数、穗粗、行粒数各性状的变异系数均大于BC5F1所构成的回交群体，而株高的变异系数略小于BC5F1所构成的回交群体。其中穗位高变异系数最大，为0.157 和0.134，变异系数最小的是穗粗，为0.057 和0.046。

2.3 各性状间的相关性分析

从表3 可以看出，株高与穗位高、穗长，穗长与穗粗、行粒数，穗行数与穗粗相关性达到极显著水平，分别为0.631、0.535、0.329、0.684、0.619。株高与穗粗、行粒数，穗位高与穗长，穗粗与行粒数达到显著水平，为别为0.286、0.273、0.266、0.201。

2.4 DH 群体的遗传分离分析

从100 对SSR 引物中筛选亲本中具有多态性的引物，图1 为部分SSR 引物筛选结果，从图1 可见，大部分引物都不具有多态性，其中有2 对引物具有多态性。在100 个标记中共筛选出20 个分子标记在2 个亲本间都具有不同的带型，DH 系具有亲本之一的带型。图2 为umc1546 分子标记分离的琼脂糖凝胶电泳，其中1 为A619Ht3 带型，2 为辽3162带型，其余为各DH 系带型。

表1 DH 系各性状的方差分析

表2 不同回交世代DH 群体变异系数

表3 各性状间的相关性分析

在50 个BC1F1DH 系中，所用引物都没有表现出明显偏离1∶3 比率的分离。卡方检验结果表明所用的20 对引物分子标记的χ2值在0. 003～2.24，差异较大的有8 号染色体上的umc2356 和bnlg2181，未达到显著水平（表4），所以在DH 系群体中2 个亲本的SSR 标记在DH 系中未发现明显偏分离的现象。

表4 SSR 分子标记在BC1F1 所构成DH 群体的分布

3 结论与讨论

DH 系在主要农艺性状上均表现为高度的一致性且其变异分布范围与RIL 基本一致[5]。试验结果表明，不同回交世代所创制的DH 系在主要农艺性状上均表现为高度的一致性，并在株高、穗位高等重要性状上的差异均达到极显著水平，高世代的DH 系各农艺性状在变异系数上除了株高外，其他均小于低世代的DH 系，这可能与高世代回交群体更接近于亲本有关，但其所产生的DH 系应有丰富的变异类型。

在杂交后代群体中，某一位点基因型分离比例的观察值不符合孟德尔分离比例的一种现象称为偏分离，偏分离产生的原因是杂交亲本之间存在不相容性[6-7]，在自然界中，偏分离是常见的现象。在玉米DH 系的研究上，Beuamont 利用玉米花粉离体培养发现了偏分离现象[8]。而近年来，随着玉米孤雌生殖的应用，也有大量的应用DH 或孤雌生殖单倍体进行偏分离研究的报道[9-11]。该研究用20 个SSR 引物对BC1F1DH 系进行研究，没有发现偏分离现象，从一定程度上说明了孤雌生殖诱导系分离的稳定性，同时随着应用标记数量的扩大和群体数量的增加，可能会发现偏分离现象。