下呼吸道流感嗜血杆菌定植对哮喘小鼠气道炎症的影响及信号通路的研究

康建强，董杨阳，杨 玲，宋 珍，范嘉盈

（1.上海交通大学医学院附属新华医院老年科，上海 200092；2.上海市虹口四川北路街道社区卫生服务中心，上海 200080；3.上海交通大学医学院医学检验系，上海 200025）

研究者发现，反复发生呼吸道感染的儿童更易患过敏性疾病[1]，因此人们开始注意呼吸道定植菌与哮喘的关系。哥本哈根的研究人员对321 例儿童进行分析，发现如果在1 个月大的新生儿的呼吸道中存在流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡塔莫拉菌等细菌定植，患儿5 年内发生哮喘的概率会增加，提示细菌等微生物定植是人类发生慢性呼吸道炎症的重要环境易感因素[2]。研究提示，下呼吸道有细菌定植的哮喘患者病情控制差，容易反复加重[3]。70%的无症状和75%的急性喘息型哮喘患者呼吸道中最常见的细菌是流感嗜血杆菌，而仅有33%的正常儿童呼吸道中有此种细菌定植[4]。呼吸道细菌定植和感染在哮喘的发病和疾病进展中有一定的作用，但其机制目前尚不明确[5]。细胞表面的Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）对于细菌引起的核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的活化和炎症因子的分泌非常关键[6]。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是哮喘炎症中的重要启动因子，NF-κB 和髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）是主要的炎症信号通路。因此，本研究采用C57/B6 野生型小鼠作为实验动物，用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）制备哮喘模型，在气管内注入琼脂包被的流感嗜血杆菌菌珠，制作细菌定植模型，在注菌后的第7、21 天处死小鼠，检测血清中TNF-α 的含量、肺组织中NF-κB 和MyD88 的表达，并与TLR4-/-小鼠作比较，进一步讨论细菌定植与哮喘气道炎症间的关系及其信号通路。

材料与方法

一、材料

64 只C57/B6 小鼠购自上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心,64 只TLR4-/-小鼠购自南京大学南京生物医药研究院，6～8 周龄，体质量为（20±2）g。

1.实验分组：C57/B6 小鼠64 只，随机分为2 组，分别为对照组（N 组）和哮喘组（A 组），每组32 只。N 组小鼠随机分为4 组，每组8 只，为NC7组（正常对照组第7 天）、NS7组（注流感嗜血杆菌后第7天），NC21组（正常对照组第21 天）、NS21组（注流感嗜血杆菌后第21 天）；A 组随机分为4 组，每组8 只，为AC7组（哮喘组第7 天）、AS7（哮喘注流感嗜血杆菌后第7 天）、AC21组（哮喘组第21 天），AS21（哮喘注流感嗜血杆菌后第21 天）。64 只TLR4-/-小鼠处理及分组同上。

2.模型制作：①哮喘模型，A 组小鼠用OVA 制作哮喘模型，N 组用0.9%NaCl 溶液代替。②琼脂包被的细菌悬液的制作，参考文献[7-8]琼脂包被流感嗜血杆菌，制作成细菌悬液，用肉汤调节浓度至108cfu/mL。③注菌，在哮喘造模的第38 天，往小鼠气管注入0.02 mL 细菌悬液，对照组注入无菌琼脂颗粒。注菌后第7、21 天取标本。

3.支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数：收集肺泡灌洗液，进行Wright′s（瑞氏）染色后，计细胞数。

4.炎症因子检测：注菌后第7 和21 天，从小鼠心脏取血1 mL 左右，行1 500 r/min 离心15 min，取上清液，进行酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定炎症因子TNF-α。

5.肺组织中MyD88、NF-κB 水平检测：制作小鼠肺组织石蜡切片，采用免疫组织化学(免疫组化)二步法测定其中的MyD88、NF-κB水平。

6.统计学处理：应用SPSS 19.0 软件进行数据分析，定量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

本研究中小鼠哮喘模型制模成功率为100%，无死亡小鼠。

一、BALF 细胞总数

BALF 中细胞总数计数结果显示，与同时间组、同种小鼠NC 组相比，NS、AC、AS 各组均明显增高（P<0.05）；与同种小鼠AC7组相比，第7 天的AS 组BALF 细胞总数显著增高（P<0.05）；与C57/B6 组相比，同时间（第7 天、第21 天）TLR4-/-的NS 组BALF 中细胞总数计数显著降低（P<0.05）；TLR4-/-的AS7组也较同时间段C57/B6 小鼠BALF 中细胞总数计数降低（P<0.05）（见表1）。

二、各组血清TNF-α 含量

与注射0.9%NaCl 组（NC7及NC21）、流感嗜血杆菌呼吸道定植组（NS7和NS21）相比，C57/B6 及TLR4-/-流感定植哮喘小鼠组（AS7和AS21）TNF-α 含量增加（P<0.05）；与C57/B6 AS 组相比，各对应时间TLR4-/-的AS 组TNF-α 含量显著减少（P<0.01）（见表2）。

三、肺组织中MyD88 表达量变化（见图1～3）

MyD88 所占同一视野的细胞百分比的结果显示，注菌后第7 天，与C57/B6 的NC7组相比，C57/B6 组的NS7组、AC7组和AS7组MyD88 表达量均显著增高（P<0.05）；与TLR4-/-组的NC7组相比，TLR4-/-组的NS7组MyD88 表达量显著增高（P<0.05）；与同种小鼠的AC7组相比，C57/B6 和TLR4-/-组的AS7组MyD88 表达量显著增高（P<0.05）；与C57/B6 的AS7相比，TLR4-/-组的AS7组MyD88 表达量相对降低（P<0.05）。注菌后第21 天，与NC21组相比，C57/B6 组NS21组（P<0.05）和AS21组（P<0.01）MyD88 表达量显著增高；与同种小鼠的AC21组相比，C57/B6 组的AS21组MyD88 表达量显著增高（P<0.05）；与C57/B6 组的AC21组和AS21组相比，TLR4-/-组的AC21组和AS21组MyD88表达量相对降低（P<0.05）。

四、肺组织中NF-κB 表达量变化（见图4～6）

NF-κB 所占同一视野的细胞百分比的结果显示，注菌后第7 天，与C57/B6 的NC7组相比，C57/B6 组中的NS7组、AS7组NF-κB 表达量显著增加（P<0.05），与TLR4-/-的NC7组相比，TLR4-/-组的NS7组、AC7组、AS7组NF-κB 表达量显著增加（P<0.05）；与C57/B6 的AC7组相比，C57/B6 组的AS7组的NF-κB 表达量显著增加（P<0.05）；TLR4-/-组中AS7组NF-κB 表达量显著低于C57/B6 组中AS7组（P<0.05）。注菌后第21 天，与C57/B6 的NC21组相比，C57/B6 组的NS21组、AC21组、AS21组NF-κB 表达量显著增加（P<0.05）,与TLR4-/-组的NC21组相比，NS21组、AC21组、AS21组的NF-κB 表达量显著增加（P<0.05）；C57/B6 的AS21组的NF-κB 表达量显著高于AC21组（P<0.05）；TLR4-/-组的NS21组、AS21组NF-κB 表达量显著低于C57/B6 组的相同时间对应组（P<0.05）。

表1 BALF 中细胞总数计数（±s）

表1 BALF 中细胞总数计数（±s）

a)：与NC 组（同时间段、同种小鼠）比较，P<0.05；b)：与AC 组（同时间段、同种小鼠）比较，P<0.05；c)：表示与同时间段C57/B6 组比较，P<0.05

表2 血清TNF-α 含量（pg/mL，±s）

表2 血清TNF-α 含量（pg/mL，±s）

a)：表示与NC 组（同时间段、同种小鼠）比较，P<0.05；b)：表示与AC 组（同时间段、同种小鼠）比较，P<0.05；c)：表示与同时间段TLR4-/-组比较，P<0.01

图1 C57/B6 组和TLR4-/-组在菌第7 天肺组织MyD88 免疫组化染色结果（二步法，×400）

图2 C57/B6 组和TLR4-/-组在第21 天肺组织MyD88 免疫组化染色结果（二步法，×400）

图3 C57/B6 组和TLR4-/-组在第7 天（A）和第21 天（B）肺组织MyD88 表达量的比较

图4 C57/B6 组和TLR4-/-组在第7 天肺组织NF-κB 免疫组化染色结果（二步法，×400）

图5 C57/B6 组和TLR4-/-组在第21 天肺组织NF-κB 免疫组化染色结果（二步法，×400）

图6 C57/B6 组和TLR4-/-组在第7 天（A）和第21 天（B）肺组织中NF-κB 表达量的比较

讨 论

有研究对662 例哮喘儿童的呼吸道定植菌进行定量分析，发现流感嗜血杆菌、卡塔莫拉菌的定植引起Th1、Th2、Th17 细胞增多，从而引起白细胞介素1β、TNF-α 的高水平表达[9]。可见细菌定植与Th 细胞的产生及炎症因子的表达间存在着重要联系，可能与哮喘的发生息息相关。

TLR 通过识别病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）来发挥作用，激活免疫应答，引起各种呼吸道炎症疾病，如哮喘[10]。研究证明，TLR2 和TLR4 在肺组织中的表达均与哮喘相关[11-13]。经典的PAMPs 来自革兰阴性细菌的脂多糖。脂多糖触发TLR4，启动细胞内部信号通路[14]，通过MyD88 发出反应信号[15]，肺组织主要病原体均通过MyD88 介导信号的表达[16]。一项关于肺损伤的研究中发现，TLR4 通过激活Myd88/NFκB 途径引起肺损伤[17]。研究表明，脂多糖可激活TLR4，通过TLR4-MyD88-P65 介导炎症反应[6,18]。

本研究通过免疫组化检测发现，C57/B6 组的NS 组和AS 组在第7、21 天与各自对照组（对应时间的NC 和AC 组）相比，MyD88 表达量均显著增加，提示气道注入流感嗜血杆菌后，肺组织的MyD88 表达量有所增加；而TLR4-/-组的AS 组与相应的时间的AC 组相比，MyD88 表达量的增加没有统计学意义，且与C57/B6 组的相同时间的AS 组相比，MyD88 表达量相对降低，提示在哮喘合并流感嗜血杆菌定植的时候，流感嗜血杆菌可能通过菌壁中的脂多糖激活TLR4，从而启动了MyD88 依赖性途径。但值得注意的是，TLR4-/-组的NS 组在注菌后第7 天时MyD88 表达量也显著增加，但第21 天的增加没有统计学意义，这可能是流感嗜血杆菌在不需要TLR4 介导的情况下，也能使部分MyD88 的表达增加，启动信号通路，其具体机制目前尚不清楚，推测是注入的细菌改变了气道微生物的群体环境。

本研究通过免疫组化检测各组的NF-κB 发现，C57/B6 小鼠的注菌各组与NC 组（包括第7 天和第21天）相比，NF-κB 均高表达，说明流感嗜血杆菌在气道的感染会增加NF-κB 的表达，此外，小鼠患哮喘之后肺组织也会增加NF-κB 的表达。本研究发现在第7、21 天的AS 组和第21 天的NS 组，TLR4-/-的NF-κB 的表达量分别与相应时间的C57/B6 组的AS、NS 组相比，相对减少，这说明哮喘合并流感嗜血杆菌气道定植后，可能由于TLR4 的激活导致NF-κB 转录因子活化，从而介导炎症的放大。但是研究也显示，TLR4-/-组的各组注菌以及哮喘造模后肺组织也有NF-κB 的表达增加，这也提示虽然TLR4 参与了哮喘合并流感嗜血杆菌定植后NF-κB表达增加的过程，但NF-κB 表达的增加并不完全依赖于TLR4 的激活。

本研究检测了小鼠BALF 中的细胞总数，结果显示，注菌第7 天时，C57/B6 组和TLR4-/-组的AS7组BALF 细胞总数远高于同种小鼠其他各组，反映了当哮喘合并流感嗜血杆菌定植后促进了炎症的发生、发展，而TLR4-/-组在注菌后与C57/B6 注菌对应组相比，BALF 细胞总数减少，说明TLR4 参与了细菌促进炎症的过程。第21 天时，C57/B6 组和TLR4-/-组的AS 组BALF 细胞总数依旧高于他同种小鼠其各组，说明细菌定植之后促使炎症反应的效果持续存在。

TNF-α 是哮喘炎症中的重要启动因子，其升高会引起炎症介质的瀑布样连锁反应，增加炎症细胞对气道的浸润，使气道上皮细胞脱落，导致气道高反应，诱发和加重哮喘[19-20]。研究表明，TNF-α 的水平在哮喘急性发作期患者的痰及BALF 中显著高于缓解期及健康对照组，其在重度哮喘患者中的水平显著高于轻度哮喘患者[21]。由上文可知，流感嗜血杆菌的感染和定植可以介导炎症的发展，本研究发现，C57/B6 组和TLR4-/-组其第7、21 天的AS 组BALF 中的TNF-α 均远高于其他各组，且相较于C57/B6 组，同时间的TLR4-/-各组TNF-α 含量减少，证实哮喘合并流感嗜血杆菌定植促进了炎症的发展，且TLR4 参与了这个过程。

总之，哮喘合并流感嗜血杆菌的定植对气道炎症和气道重塑有重要的作用，流感嗜血杆菌不仅通过菌体本身损害气道黏膜，也可能通过菌壁的脂多糖成分激活TLR4，通过TLR4-MyD88-NF-κB 途径导致气道炎症的加重，进一步影响哮喘的发生、发展。