DNMT3A R882突变在急性髓系白血病中的临床意义

王 蕾，杨艳丽，张 凤，李佳佳，耿英华，李 骏

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类严重危害人类健康的异质性血液系统恶性肿瘤，发病率占我国成人白血病首位。DNA甲基化转移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)位于人类2号染色体短臂2区3带(2p23)，是重要的甲基化转移酶之一，主要负责基因组DNA从头甲基化，在多种恶性肿瘤的发病机制中发挥重要作用[1-3]。研究[4-13]发现，在成人AML病人中DNMT3A R882位点高频突变，且常合并某些高危因素，是病人预后不良的重要分子生物学标志。本研究旨在通过收集临床骨髓标本及检测DNMT3A R882位点突变情况，探讨DNMT3A R882突变与AML发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2012年12月至2015年12月在蚌埠医学院第一附属医院被诊断为初发AML病人的骨髓标本116例及被诊断为缺铁性贫血病人的骨髓标本30例作为良性对照组。AML组男71例，女45例，年龄18～89岁。临床分型：M1型15例，M2型36例，M4型30例，M5型35例。所有病人均经细胞形态学、流式免疫学、细胞遗传学及分子生物学检查，并按照FAB国际分型标准明确诊断。良性对照组样本30例，男12例，女18例，年龄23～75岁。所有骨髓标本均经病人或家属签署知情同意书。

治疗方案：AML病人住院后均接受诱导缓解治疗，方案为蒽环类药物+阿糖胞苷(3 d+7 d)，如IA(去甲氧柔红霉素3 d+阿糖胞苷7 d)、DA(柔红霉素3 d+阿糖胞苷7 d)等，剂量参照《血液科临床处方手册》，并根据病人身高、体质量及体表面积而定。

疗效及随访：对116例AML病人通过查询住院病历、门诊病历及打电话方式进行随访，随访截止日期为2016年12月31日。完全缓解(complete remission,CR)定义为病人经初次或2次诱导缓解治疗后满足以下条件：(1)白血病症状及体征消失；(2)外周血中性粒细胞绝对数≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，白细胞分类中无白血病细胞；(3)骨髓原始细胞总数≤5%。总体生存时间(overall survival time，OS)定义为AML被确诊之日至死亡或末次随访的时间。无病生存时间(disease-free survival time,DFS)定义为经治疗获得CR后至复发或死亡的时间。

1.2 主要试剂和仪器 超低温冰箱(-80 ℃)、低温高速离心机(Thermo科技公司)；核酸蛋白检测仪(Eppendorf科技公司)；梯度PCR扩增仪(东胜国际贸易有限公司)；水平式凝胶电泳槽及电泳仪、全自动凝胶成像系统(Tanon科技公司)；DNA上样缓冲液(6×)、TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技有限公司)；Marker、5×TBE缓冲液、溴化乙锭(上海生物工程股份有限公司)。

1.3 DNA提取及突变检测 将收集到的骨髓标本提取单个核细胞后，根据DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，置于分光光度计中检测DNA浓度及纯度，并通过聚合酶链式反应及琼脂糖凝胶电泳，将高纯度的DNA送于上海生物工程股份有限公司进行DNMT3A R882突变检测。

1.4 统计学方法 采用秩和检验、χ2检验和Log-rank检验。

2 结果

2.2 AML中DNMT3A R882突变型与野生型病人基本资料比较 DNMT3A R882在核型正常的AML组(NK-AML组)病人中突变率为19.4%，高于在核型异常的AML组病人中突变率的4.5%(P<0.05)。M4、M5分型人数在DNMT3A R882突变型AML组(Mut-DNMT3A组)中占75.0%，在DNMT3A野生型AML组(Wild-DNMT3A组)中占30.0%，2组间差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

另外，Mut-DNMT3A组病人年龄大于Wild-DNMT3A组(uc=2.32，P<0.05)；Mut-DNMT3A组病人外周血白细胞数、血小板数高于Wild-DNMT3A组(P<0.05)，但2组间病人性别、骨髓原始细胞数、外周血血红蛋白数差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间病人基本资料的比较

变量DNMT3A R882突变 (+) (-) tP性别 男 女11560400.45∗>0.05年龄/岁59.5±13.545.0±15.22.32<0.05骨髓原始细胞数/% 69.2±21.662.1±18.30.87>0.05白细胞数/(×109/L)43.2±21.926.4±23.42.08<0.05血红蛋白/(g/L) 83.9±26.975.2±21.10.57>0.05血小板/(×109/L)74.3±40.137.8±39.73.02<0.01NK-AML组 非NK-AML组 14258425.91∗<0.05M4、M5分型组M1、M2分型组124307012.09∗<0.01

*示χ2值

2.3 AML中DNMT3A R882突变型与野生型病人融合基因比较 检测成人AML病人中融合基因的表达是判断病人病情与预后的重要指标，本实验中发现CBFβ-MYH阳性者在Mut-DNMT3A组中占12.5%，在Wild-DNMT3A组中占8.0%，2组间差异无统计学意义(P>0.05)；AML1-ETO阳性者在Wild-DNMT3A组中占18.0%，而在Mut-DNMT3A组中未发现表达阳性者，2组间差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2.4 AML中DNMT3A R882突变与野生型病人细胞免疫表型比较 Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组细胞表面CD117、CD13、CD33、CD36、CD14、CD15、CD56、CD64、MPO、HLA-DR表达差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表2 Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间病人融合基因的比较

融合基因DNMT3A R882突变 (+) (-) 校正χ2PCBFβ-MYH 阳性 阴性2148920.01>0.05AML1-ET0 阳性 阴性01618822.17>0.05

表3 Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间病人细胞免疫表型比较

CD抗原DNMT3A R882突变 (+) (-) χ2PCD117 阳性 阴性8856440.20>0.05HLA-DR 阳性 阴性15185150.89>0.05CD13 阳性 阴性12478220.07>0.05CD33 阳性 阴性11575250.28>0.05CD15 阳性 阴性11553471.38>0.05MPO 阳性 阴性13372280.60>0.05CD56 阳性 阴性31322780.09>0.05CD36 阳性 阴性41213871.59>0.05CD64 阳性 阴性3139911.41>0.05CD14 阳性 阴性8838620.83 >0.05

2.5 疗效及临床预后 116例AML病人住院期间接受诱导缓解治疗后，16例Mut-DNMT3A病人中有7例CR，CR率为43.8%，100例Wild-DNMT3A组病人中有47例CR，CR率为47.0%，2组间CR率差异无统计学意义(χ2=0.06，P>0.05)。

进一步分析Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组之间的OS率及DFS率，结果显示，Mut-DNMT3A组病人中位生存时间为12个月，Wild-DNMT3A组病人中位生存时间为28个月，Mut-DNMT3A组病人OS率及DFS率均低于Wild-DNMT3A组病人，且差异有统计学意(χ2=4.29、6.16，P<0.05)。

3 讨论

本实验检测到DNMT3A R882在AML组中突变率为13.8%，在良性对照组中无突变，由于对照组中病例数偏少，2组间差异无统计学意义。DNMT3A R882在NK-AML中突变率为19.4%，与以往发现的DNMT3A R882在AML中突变率为9.3%～19.7%、在NK-AML中达18.1～27%[4-11]相符。

细胞表面相关免疫表型的表达可以判断骨髓细胞来源及发育程度，章梁君等[9]研究指出DNMT3A R882突变的AML病人中细胞表面CD14与CD56分子表达显著增高，而本研究虽然显示M4、M5分型的病人人数在Mut-DNMT3A组中所占比例高于Wild-DNMT3A组，不过在分析2组间细胞免疫表型表达时，发现2组间与单核细胞表面标志相关的CD14、CD64、CD36、CD56分子表达差异并无统计学意义，这可能是因为细胞表面CD分子分化程度，或是成熟程度不一所造成的结果。

我们在分析Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间AML1-ETO及CBFβ-MYH融合基因时，发现2组间人数差异均无统计学意义，但我们的研究发现Mut-DNMT3A更易发生于NK-AML病人，且EL GHANNAM 等[8]研究发现Mut-DNMT3A常伴有 NMP1、FLT3-ITD突变，特别是 NMP1突变常与DNMT3A R882突变关系密切[ 6-10]。这可能是由于我们分析的融合基因种类少的原因，且提示当病人染色体核型正常，合并NMP1、FLT3-ITD突变时，可进一步检测DNMT3A R882突变。

我们虽然发现Mut-DNMT3A组病人年龄、外周血白细胞数及血小板数高于Wild-DNMT3A组，与HOU等[7]发现的其中一部分相符，但其亦指出Mut-DNMT3A组病人中骨髓原始细胞数显著增加，而我们的研究显示Mut-DNMT3A组病人骨髓原始细胞数虽然较Wild-DNMT3A组病人增加，但差异无统计学意义。也有研究[12]指出AML病人骨髓原始细胞数、外周血白细胞数、血小板数及年龄与DNMT3A R882是否突变无关。造成各研究中出现差异的原因可能有人种的不同、病例收集数量不同、实验研究方法不同及误差等。

大量研究[10-13]显示DNMT3A R882突变病人复发率极高、生存率下降，预示着病人预后不良。本实验中发现Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间病人CR率差异虽无统计学意义，但Mut-DNMT3A组病人OS率、DFS率较Wild-DNMT3A组病人均下降，提示DNMT3A R882突变可能是AML病人预后不良的生物学标志。

通过本实验研究可以得出DNMT3A R882突变易发生于AML病人，特别是NK-AML或M4、M5病人，且常合并高龄、高白细胞危险因素，DNMT3A R882突变使OS率及DFS率显著下降，是病人预后不良的生物分子学标志，也提示DNMT3A R882突变在AML的发病机制中发挥重要作用，仍需大量研究进一步阐明细胞分子生物学机制在其中的作用。