神经生长因子纳米途径给药对糖尿病大鼠创面修复的研究*

谢沛霖，司小强，高正君，林沛婷，薛晓东*

(甘肃省人民医院整形外科，兰州 730000)

糖尿病足发病率逐年增加，是一种难愈合的慢性创面，致残率很高。近来出现一种新型换药模式：纳米途径创面缓释用药，不仅能起到传统换药的作用，还能更有效地帮助创面加速愈合。研究[1-2]表明神经生长因子和壳聚糖均能起到促进创面愈合的作用，文献[3-4]报道表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合壳聚糖能促进创面愈合。但神经生长因子制成壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶促进创面愈合尚未见报道。据临床观察，神经生长因子在创面愈合及预防瘢痕方面均强于表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子，如果本研究能成功研制含有神经生长因子且性状稳定的壳聚糖纳米颗粒缓释制剂，将对糖尿病慢性创面的愈合起到巨大的作用，因为该制剂制作材料来源广泛，制作工艺相对简单，能够大量普及于临床，为广大患者造福。因此本研究具有明确的目的和临床治疗中的现实意义。

1 材料与方法

1.1 壳聚糖纳米颗粒的制备 乙酸溶液的配制：取0.3 mL乙酸溶于100 mL消毒去离子水，配制成0.3%(v/v)。壳聚糖液的配制：取100 mg壳聚糖(上海麦克林生化科技有限公司)溶于50 mL上述乙酸溶液，配制成0.2%(w/v)，用0.22 μm消毒小滤器过滤。多聚磷酸钠(tripoly phosphate,TPP)液的配制：取20 mg TPP溶于20 mL消毒去离子水，配制成0.1%(w/v)。空白壳聚糖纳米颗粒的配制，6 mL TPP液加入15 mL壳聚糖液，室温，磁力搅拌，自动形成乳白色悬液，用0.22 μm小滤器过滤。

1.2 神经生长因子-壳聚糖液的配制 将20 μg(9000U)鼠神经生长因子(武汉海特生物制药股份有限公司)溶于100 mL壳聚糖液，取0.2 mL TPP液加入0.5 mL神经生长因子-壳聚糖液，在室温条件下高速振荡，此时混合物会自动形成乳白色悬液。

1.3 神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶封包率检测 取部分神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒，以10 000 r/min离心10 min，用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测得上清中神经生长因子OD450吸光度值，根据标准曲线方程：y=241.07x2+422.04x-35.344计算上清液中神经生长因子的量，然后应用以下公式计算神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒封包率：药物封包率=(实际药物总浓度-游离药物浓度)/实际药物总浓度总量×100%。

1.4 神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶稳定性检测 凝胶制作完成后于第4、8、12、24 h取4 ℃条件下贮存的部分神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒，采用空白壳聚糖纳米颗粒作空白对照，以10 000 r/min离心10 min，用ELISA法测得上清中神经生长因子OD450吸光度值，计算上清液中游离神经生长因子的量，然后应用以下公式计算神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶降解率：纳米缓释凝胶药物降解率=游离药物浓度/凝胶内实际药物总浓度×100%，以此反映纳米颗粒的稳定性。

1.5 实验性动物分组与模型制 清洁级雄性Wistar大鼠60只(甘肃中医药大学实验动物中心)，体质量200～220 g。给予用柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美国Sigma公司)采用两步给药法腹腔注射，剂量为第1天10 mg/kg，第3天50 mg/kg。正常对照组予相同剂量柠檬酸缓冲液腹腔注射，1周后检测血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L视为糖尿病造模成功(表1)。10%水合氯醛液腹腔内注射麻醉(30 mg/kg)，背部脱毛，次日同法麻醉后，用96 ℃恒温水蒸气在大鼠背部造成两个直径约2.5 cm圆形深Ⅱ度烫伤。将大鼠随机分为A组：壳聚糖(上海麦克林生化科技有限公司)凝胶给药组；B组：神经生长因子(上海博士德公司)给药组；C组：神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶给药组；D组：对照组。本实验经甘肃中医药大学动物伦理委员会批准。

表1 各组大鼠血糖控制(,mmol/L)

表1 各组大鼠血糖控制(,mmol/L)

1.6 治疗方法 将每只大鼠单笼喂养，伤后创面换药2次/d。A组外敷3层纱布浸润5 mL神经生长因子溶液25 U/mL；B组外敷4%壳聚糖凝胶后3层纱布覆盖；C组外敷神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶后3层纱布覆盖；D组外敷3层纱布浸润5 mL生理盐水。

1.7 观察指标

1.7.1 创面愈合率 于伤后3、7、11、15、21 d每组用网格纸和标记笔沿创面边缘画出轮廓，用OSIRIS通用医学图像处理与分析软件计算创面愈合率：创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.7.2 大体观察 观察伤后3、7、11、15、21 d各组大鼠创面愈合情况。

1.7.3 病理组织学检查 于伤后3、7、11、15、21 d取大鼠背部创面组织。标本常规石蜡包埋切片，HE染色，行光镜组织学观察。

1.7.4 免疫组化染色阳性结果判定标准 以细胞核或细胞质呈棕黄色为阳性表达。选取阳性区域并用成都泰盟BI-2000图像分析系统中的免疫组化分析软件计算灰度值来定量分析各组内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)及B淋巴细胞瘤相关X蛋白(Bcl-associated X protein,Bax)表达含量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 24.0软件分析，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶 制作出神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶，可见凝胶颗粒均匀分布，大小一致，无团块聚集(图1)。

2.2 神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶封包率 将多次OD450测量的游离神经生长因子吸光值结果代入标准曲线方程：y=241.07x2+422.04x-35.344，计算得出游离神经生长因子浓度，再根据公式：药物包封率=(实际药物总浓度-游离药物浓度)/实际药物总浓度总量×100%，计算凝胶封包率，取平均值后得出神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶封包率为28.29%。

2.3 神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶稳定性检测 用ELISA法结合OD450吸光度检测在4 ℃条件下该药物降解率，结果表明神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒凝胶具有稳定性：4、8、12、24 h的降解率分别为4.9%、9.1%、16.7%、25.5%，24 h内降解率＜30%，没有突释效应；计算缓释性：平均每小时降解1.06%。

2.4 大鼠大体观察 烧伤后第1～3天可见各组大鼠出面均出现水肿，D组创面血浆性渗出较多，A、B、C组渗出较D组少。烧伤后第7天D组创面无明显缩小，大部分创面被痂皮覆盖，有渗出及分泌物形成；A、B、C组创面均有不同程度缩小；渗出量也比D组减少。烧伤后11～15 d A、B、C组创面出现缩小，C组缩小最为明显，A、B、C组均有肉芽组织出现，以C组最明显，D组创面缩小约30%，仍有大量不新鲜肉芽组织及分泌物形成。烧伤后第21天，C组创面大部分愈合，D组创面仍有约50%未愈合，部分创面仍有痂皮附着，可见不新鲜肉芽组织及分泌物形成，其余各组愈合情况在C、D组之间(图2)。

2.5 组织学观察 伤后第3天，各组创面胶原纤维肿胀变性，融合坏死，部分毛囊及皮脂腺崩解；其中D组真皮组织内见少量炎性细胞，A、B、C组真皮层有较多炎性细胞浸润，其中C组最明显，各组表皮及真皮部分细胞坏死，胶原纤维肿胀，融合坏死，大部分毛囊及皮脂腺崩解。伤后第7天，镜下各组炎性细胞均较前明显曾加，A、B、C组创面真皮层深层可见少量新生肉芽组织，C组真皮层可见少量新生毛细血管形成，D组未见明显毛细血管形成。伤后第11～15天，C组毛细血管较7 d时增多并出现大量成纤维细胞和胶原纤维，排列有序；A、B组毛细血管仍较多，出现纤维细胞；D组真皮层仍有少量炎性细胞外，可见少量毛细血管形成。伤后第21天，C组创面大部分上皮化完成，少量残余创面可见毛细血管形成及排列整齐胶原纤维，D组偶见表皮细胞出现，上皮组织尚未形成，真皮全层仍可见大量炎性细胞和肉芽组织，偶见毛细血管；A组观察情况与B组相似，但真皮层炎性细胞、肉芽组织及新生毛细血管较B组多(图3)。

2.6 各组创面愈合率比较 通过计算创面愈合率可知：伤后各时间点C组创面愈合率均高于其余各组(均P＜0.05)，C组第21天已达到(79.53±4.75)%。D组创面愈合率均低于其他各组，第21天仅为(45.14±6.57)%。A、B组愈合率在两者之间，见表2。

表2 各组大鼠伤后不同时间点创面愈合率比较(,%)

表2 各组大鼠伤后不同时间点创面愈合率比较(,%)

注：F=5.139、21.396、15.357、20.021、54.973；与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05。

2.7 各组VEGF、HIF-1α、Bcl-2及Bax免疫组织化学观察及图像分析

2.7.1 各组大鼠VEGF灰度值比较 第3天后开始各组VEGF灰度值开始上升，至第15天达到峰值，之后缓慢回落，第3～11天除A组与C组的表达差异无统计学意义(P＞0.05)外，其余各组之间表达差异均有统计学意义(均P＜0.05)；第11～21天各组VEGF灰度值差异均有统计学意义(均P＜0.05)，其中C组各时间点的表达均高于其他各组，而D组各时间点的表达均低于其他各组；在第21天C组表达最高，而D组最低，见表3、图4。

2.7.2 各组大鼠HIF-1α 灰度值比较 第3天开始直至第21天各组HIF-1α 灰度值均处于持续回落状态，除了第7天A组与B组差异无统计学意义(P＞0.05)外，其他各组差异均有统计学意义(均P＜0.05)。C组回落最快，D组回落最慢，其他两组在C组与D组之间；第21天C组为全组最低，而D组最高；见表4、图5。

表3 各组大鼠伤后不同时间点VEGF灰度值比较()

表3 各组大鼠伤后不同时间点VEGF灰度值比较()

注：F=24.412、289.526、146.509、248.597、133.735；与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05。

表4 各组大鼠伤后不同时间点HIF-1α 灰度值比较()

注：F=63.048、70.247、99.287、136.296、181.867；与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05。

2.7.3 各组大鼠Bcl-2灰度值比较 Bcl-2的灰度值表达除了第11天A组与B组差异有统计学意义(P＜0.05)外，其余时间差异均无统计学意义(均P＞0.05)。各组的表达在第3～15天增长达到最高峰后开始回落，C、D组与其他各组差异均有统计学意义(P＜0.05)，第21天C组表达最高，而D组最低，见表5、图6。

表5 各组大鼠伤后不同时间点Bcl-2灰度值比较()

表5 各组大鼠伤后不同时间点Bcl-2灰度值比较()

注：F=20.649、57.290、71.806、104.812、32.311；与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05。

2.7.4 各组大鼠Bax灰度值比较 各组Bax表达从第3天开始均处于下降趋势，从7～21 d各组差异均有统计学意义(均P＜0.05)，其中C组下降最明显，而D组下降最慢，在第21天，C组表达降至各组最低，而D组为各组最高；见表6、图7。

表6 各组大鼠伤后不同时间点Bax灰度值比较()

表6 各组大鼠伤后不同时间点Bax灰度值比较()

注：F=58.953、95.095、181.888、139.138、225.547；与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05。

3 讨论

糖尿病足是由于糖尿病造成的周围神经病变及外周血管病变而导致的足部感染、缺血缺氧，溃疡合并深部组织破坏造成长期溃烂，迁延不愈[5]，患者需长期卧床，丧失行走功能，多数患者最终因治疗条件受限或信心丧失而选择了截肢，并且截肢术后70%糖尿病患者会在5年内死亡[6-7]，其治疗过程给家庭及社会增添了巨大的负担。因糖尿病本身存在糖代谢及脂质代谢紊乱，其产生的晚期糖基化终末产物在糖尿病慢性并发症的发病机制中起到重要作用，其通过损伤血管内皮细胞来影响患者微血管系统，可降低血管内皮细胞的增殖及分化并能够增加其凋亡[8]。晚期糖基化终末产物还能通过多种途径引起氧化应激，能够使得正常皮肤胶原产生糖基化，其对嗜中性粒细胞受体具有高度亲和性，两者结合后导致嗜中性粒细胞经内皮细胞迁移产生的杀菌作用受限。有研究[1]表明嗜中性粒细胞无法及时达到糖尿病溃疡中心形成炎症聚集区，而被分散到溃疡周边。该研究也证实了糖尿病患者创面的肉芽组织生长少于正常患者创面，使得创面愈合速率会明显下降。当然，影响糖尿病慢性创面的不愈合的因素还有很多，例如：长期消耗导致的低蛋白血症及贫血，免疫功能异常导致局部炎症因子调节失控，微血管循环障碍导致有害因子得不到有效运输及清除等，这些原因均会影响创面愈合因。

本研究使用链脲佐菌素诱导大鼠产生1型糖尿病，并建立深Ⅱ度烫伤模型，模拟糖尿病患者的慢性溃疡，再利用神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶作用于创面，观察其对糖尿病慢性溃疡创面的愈合作用。

神经生长因子是一种功能多样的生物活性多肽，它能够促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复，但其本身具有促进创面愈合的作用[1,9]。李政懋等[10]研究也表明创面外源性给予神经生长因子，能够促进转化生长因子-β1、CD68、增殖细胞核抗原、VEGF-1 4种因子的表达，从而起到加速创面愈合的作用。

壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基后形成的氨基多糖类化合物，它存在于虾蟹等甲壳类动物的外壳中，资源非常丰富，由于其本身及其降解产物无毒性作用，组织相容性好，具有镇痛、止血、抗感染、促进肉芽组织生长及促进创面愈合作用，被广泛应用与医药卫生行业[11-12]。其促进创面愈合的作用也可能与其激活巨噬细胞有关，巨噬细胞是参与创伤修复的一种重要细胞，它能吞噬并清除外源性异物和坏死细胞，还能通过释放各种细胞因子调节创伤修复，壳寡糖可以促进巨噬细胞白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-18基因的表达，而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬细胞，形成网络状的反馈调节关系[13]。同时它也可以刺激创面中表皮生长因子和血小板源性生长因子的表达，促进创面愈合[14]。壳聚糖本身具有促进创面愈合的作用，但它也可以用于药物载体，起到药物缓释作用。壳聚糖微颗粒呈多孔疏松结构，有利于增大蛋白包裹或吸附的面积和吸引力。与传统的药剂相比较，以壳聚糖作为载体制备成纳米颗粒具有胶黏性，在创面和黏膜表面能够长时间停留，使得药物持续作用于靶目标，同时因其对药物的良好包裹，可以延长药物的生理活性，致使药物的吸收率、靶向性、溶解率均明显提高，并且还能有效控制缓释释放，减少了药物的使用剂量的同时还改善治疗效果[15-16]。

本研究通过对1型糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面模型给予不同药物治疗，与对照组对比后发现，伤后第21天给予神经生长因子-壳聚糖纳米颗粒缓释凝胶治疗的C组创面愈合率最高，对照组最低。其机制是与以下因素有关：局部应神经生长因子能够刺激毛细管内皮细胞的增殖、分化及抑制凋亡，提高内皮细胞的再生能力，促进糖尿病创面的毛细血管化，从而促进糖尿病创面的愈合[17]，其机制可能是由于上调了它的自身受体(TrkA、P75)及增加了VEGF的水平来实现的。研究[1,8]证实神经生长因子还能够刺激内皮细胞释放VEGF以及抑制高糖环境诱导的细胞凋亡，提高炎性细胞、内皮细胞等稳定性，从而促进糖尿病创面的愈合。该研究还证实与对照组相比较，神经生长因子能够提升5.5倍的VEGF表达。本研究在第15天测得C组VEGF灰度值为172.92±8.53，D组为38.07±9.44，C组约为D组的4.5倍，亦近似验证了此观点。神经生长因子通过增加VEGF水平刺激创面局部毛细血管增生，改善了局部缺血的状况，因此，C组的HIF-1α 为各组最低，而D组为各组最高。神经生长因子通过改善局部微循环，提高血管内皮细胞稳定性，改善高血糖下组织内的氧化应激，上调Bcl-2表达的同时抑制Bax的表达，从而抑制了细胞凋亡[18-19]，综合以上因素，经过局部外源性给予神经生长因子治疗后能够促进糖尿病慢性创面的愈合。

本研究同时对比了神经生长因子纳米凝胶缓释给药模式及传统给药模式，发现纳米途径给药模式的治疗效果优于传统给药模式，因为壳聚糖纳米凝胶能够将神经生长因子持续作用于创面，24 h后仍有74.5%的药物保留，降低其自然降解率，延长了药物生理活性，无突释效应，平均每小时降解率仅为1.06%，效果持久稳定，因此C组的治疗效果整体优于A组。