RhoGDI2调控TGF-β1对气道上皮-间质转化的研究*

潘 霞，陈 云，刘 华

(1 南通大学附属医院呼吸与危重症医学科，南通 226001；2 南京医科大学附属江宁医院呼吸与危重症医学科；3 南通大学附属医院血液净化中心)

支气管哮喘是以气道炎症、气道高反应性及气道重塑为特征的慢性呼吸道疾病，其中气道重塑是引起肺功能进行性下降的病理基础，进而引起劳动力丧失以及增加社会医疗负担[1]。研究[2]表明，哮喘患者的临床表现及对治疗的反应是由其病理改变所决定的。目前抗炎治疗已成为哮喘的基本治疗方法，而对气道重构的干预无特殊治疗。有研究[3]提示哮喘儿童早期使用激素抑制炎症反应并不能改善疾病的自然进程，因此探讨气道重构的发生、发展机制，寻找可能的治疗靶点，以期改善气道重塑的病情进展。

上皮细胞是处于气道的第一道防线，其结构及功能的改变是气道重塑的核心环节，近年来认为气道上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)在气道重塑过程中发挥了重要作用。至今已经发现多种调节EMT的因素，转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β1) 是目前公认的调控EMT过程的关键因子，其可通过Smad信号通路、MAPK途径、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinases/protein-serine-threonine kinase,PI3K/Akt)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及β-catenin等信号通路诱导气道EMT反应[4-5]。

鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子2(Rho guanosine diphosphate dissociation inhibitor 2,RhoGDI2)属于Rho GDP解离抑制剂家族，具有调节RhoGTPase的功能[6]。研究[7-8]表明其可调控EMT过程介导肿瘤的侵袭转移过程，但RhoGDI2在气道EMT过程中的作用尚不明确。在前期研究中，我们成功构建了哮喘小鼠气道重塑模型，发现小鼠肺组织内RhoGDI2较正常小鼠表达升高，提示RhoGDI2表达异常与气道重塑相关。目前还没有研究报道在气道重塑中，RhoGDI2与EMT之间的关系。本研究以人气道上皮细胞为研究对象，探讨RhoGDI2在EMT过程中的作用及与TGF-β1之间的潜在联系。揭示RhoGDI2在气道EMT过程中的分子生物学机制，为气道重塑的进一步研究提供理论基础及可能提供新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞系和主要试剂 人气道上皮细胞(16HBE)购自北纳创联生物技术有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培养基购自上海源培生物科技有限公司。RhoGDI2质粒、空载质粒、Lipofectamine 2000购自麦杰生物科技有限公司。E-cadherin兔抗人单克隆抗体、N-cadherin兔抗人单克隆抗体、Snail兔抗人单克隆抗体、RhoGDI2兔抗人抗体购自英国Abcam公司。TGF-β1兔抗人单克隆抗体购自南京漫秀生物科技有限公司。人TGF-β1双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自联科生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 16HBE贴壁生长，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM高糖培养基培养。待细胞生长到70%～80%时，接种于六孔板。利用RhoGDI2质粒转染细胞，同时设立对照组、阴性对照组及RhoGDI2+抑制剂组，阴性对照组是利用空载质粒转染细胞，在六孔板上做好标记。

1.2.2 细胞转染与形态学变化的观察 准备经过高压蒸汽灭菌的EP管若干。将6 μL提前稀释的质粒加至含250 μL的高糖培养基的EP管中、混匀，再将4 μL的Lipofectamine 2000加至另外含250 μL的高糖培养基的EP管中、混匀，室温静置5 min，接着再将DNA悬液和Lipofectamine 2000悬液混合，室温静置20 min。最后将混合液加至各相应的孔板中，加入DMEM-H培养基至2 mL。放入培养箱中培养。分别于转染后24、36、48 h荧光显微镜下观察RhoGDI2绿色荧光蛋白表达的情况，高倍显微镜下观察各组细胞形态的改变。

1.2.3 细胞中RhoGDI2、EMT相关蛋白及TGF-β1的含量测定 采用Western Blot检测方法。按照RIPA细胞裂解液说明书提取细胞蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，置沸水煮5 min变性蛋白质。RhoGDI2、Snail选择15%分离胶，TGF-β1选择10%分离胶，Ecadherin、N-cadherin选择8%分离胶及5%浓缩胶进行电泳。设置电泳仪参数为恒压80 V，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，恒压改为120 V，电泳60～90 min。然后在恒流300 mA、冷室转膜90 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。分别孵育1∶1 000稀释的RhoGDI2、TGF-β1、E-cadherin、N-cadherin抗体及1∶500稀释的Snail抗体，4 ℃过夜。TBST洗膜3次，10 min/次。洗膜结束后，加入稀释1∶1 000稀释的二抗，室温孵育2 h，避光。TBST洗膜3次，10 min/次。加入化学发光底物试剂反应，用凝胶成像系统显影。显影所得的条带使用ImageJ软件系统进行图像分析。以GAPDH为内参照，分析蛋白的相对含量。

1.2.4 细胞培养上清液中TGF-β1含量的测定按照试剂盒说明书进行ELISA检测。使用酶标仪进行双波长检测，分别测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值。450 nm的测定值减去630 nm的测定值为校准后的OD值。根据不同浓度标准品的校准OD值利用SPSS软件系统进行回归拟合生成标准曲线。根据标准曲线方程计算上清液中TGF-β1含量，以pg/mL表示。

1.2.5 统计学方法 使用SPSS 21.0统计软件进行分析。实验数据以表示，各组之间的比较采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoGDI2过表达细胞模型 转染后36 h转染效率最高，达70%～80%(图1A)。各组提取细胞蛋白后，行Western Blot检测细胞内RhoGDI2蛋白表达水平(图1B～C)，提示成功构建RhoGDI2过表达细胞模型。

2.2 细胞形态的改变 显微镜下显示对照组细胞形态呈鹅卵石样，RhoGDI2过表达组细胞呈梭形改变、细胞与细胞间的连接较松散。过表达组中加入TGF-β1抑制剂后可见细胞形态逆转呈鹅卵石样改变，见图2。

2.3 RhoGDI2对TFG-β1表达的影响

2.3.1 ELISA测定细胞培养上清液中TGF-β1含量表1为不同浓度标准品的校准OD值，利用SPSS软件系统进行回归拟合生成标准曲线(图3)，得出的标准曲线函数公式为y=0.00037x+0.028，相关系数R2=0.975。测定样本的OD值，根据公式计算各组细胞培养上清液中TGF-β1的含量(表2)。利用单因素方差分析提示方差齐性，使用LSD方法检验。结果提示RhoGDI2过表达组细胞培养上清液TGF-β1表达较对照组明显升高(P＜0.01)。在RhoGDI2过表达组中加入TGF-β1抑制剂后，TGF-β1表达明显降低(P＜0.01)。

表1 不同TGF-β1浓度标准品校准后的OD值

表2 各组细胞培养上清液中TGF-β1含量的比较

2.3.2 Western Blot测定细胞中TGF-β1含量 结果提示RhoGDI2过表达细胞中TGF-β1表达明显上升，加入TGF-β1阻断剂后可抑制细胞中TGF-β1的表达。

2.4 细胞中EMT相关蛋白的表达 与对照组相比，RhoGDI2过表达组E-cadherin蛋白表达明显降低(P＜0.01)，N-cadherin、Snail蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.05、P＜0.01)。RhoGDI2过表达组中加入TGF-β1抑制剂后，发现其可抑制RhoGDI2引起的EMT相关蛋白表达的变化，E-cadherin表达升高(P＜0.05)，而N-cadherin、Snail表达下降(均P＜0.01)，见图5。

3 讨论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，反复的炎症浸润、损伤修复可导致气道内壁结构的改变，包括上皮细胞脱落、黏液细胞化生、基底膜增厚、平滑肌肥大，上皮下纤维化及血管生成，此过程被称为气道重塑。气道重塑的机制尚未完全明确，异常的EMT过程被认为在气道重塑的发生、发展过程中起着关键作用。研究[9]指出，多种细胞因子可参与调控气道EMT转化过程，如TGF-β1、成纤维生长因子-2、表皮生长因子及结缔组织生长因子等。但目前认为这一过程主要是由于TGF-β1介导的信号通路驱动的。利用免疫组织化学染色法，发现哮喘患者的气道上皮、黏膜下、上皮下结缔组织及平滑肌细胞都可见TGF-β1的表达。多种气道结构细胞及炎症细胞均可分泌TGF-β1，研究[10]指出气道上皮细胞来源的TGF-β1是哮喘发病的重要因素，在气道重塑中具有关键作用。TGF-β1可与细胞表面受体结合激活细胞内信号蛋白Smads，继而转移到细胞核内与其他共激活因子调节EMT等相关基因的转录和表达[11]。研究[4-5,12]发现，TGF-β1与细胞表面受体结合也可激活非Smad信号通路参与气道EMT过程，包括RhoGTPase、MAPK途 径、PI3K/Akt、NF-κB及Wnt/β-catenin等多种信号通路。多种因素可参与调控TGF-β1诱导的EMT过程，包括过敏原暴露、炎症介质、内皮素-1及氧自由基等[13-14]。Smad信号通路、非Smad信号通路互相关联，因此很难区分它们在TGF-β1诱导的EMT过程中的作用。

RhoGDI2调控RhoGTPase在非活性状态GDP结合态和活性状态GTP结合态之间的循环，广泛参与细胞周期调控、基因转录及细胞凋亡等生命活动[6]。近年来研究[15-16]指出RhoGDI2在人类肿瘤中存在差异表达、对EMT的调控作用也不尽相同，这可能与肿瘤的类型、分期及RhoGDI2调控的下游信号通路和效应物有关。RhoGDI2在霍奇金淋巴瘤中表达较非霍奇金淋巴瘤明显减少[17]。在膀胱癌中，RhoGDI2表达随着疾病的进展而降低[18]。相反，其在卵巢癌、结肠癌乳腺癌细胞系中高表达[19-21]。在胃癌的转移机制研究[7]中发现，RhoGDI2过表达可引起E-cadherin表达减少及vimentin、纤维黏连蛋白表达增多。RhoGDI2可抑制肺癌的转移，主要通过调节与EMT过程相关的转录因子Slug、Snail的表达抑制EMT反应[8]。目前关于RhoGDI2调控EMT过程的信号通路尚不清楚，其可能与RhoGTPase、PI3K/Akt、MAPK等信号通路有关[15,22-23]。Y.FANG等[15]研究发现肝癌细胞中RhoGDI2表达明显升高，通过促进Akt、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9的表达介导转移侵袭过程。一项关于膀胱癌研究[15]提示，RhoGDI2可抑制miR-200c的表述，从而促进JNK2的表达，JNK2可激活转录因子Sp1结合到MMP-2的启动子区域，促进MMP-2的表达。有研究[24]通过构建β2肾上腺素能受体减敏哮喘小鼠模型，利用蛋白质组学分析方法发现了RhoGDI2。本研究结果表明RhoGDI2过表达可引起E-cadherin表达减少，N-cadherin、转录因子Snail表达增加，提示RhoGDI2可诱导气道EMT过程，为研究RhoGDI2在气道重塑中的作用奠定了基础。

为进一步了解RhoGDI2是如何调控气道EMT过程的，本研究检测细胞中及培养液中TGF-β1的蛋白表达量，结果提示RhoGDI2过表达可引起TGF-β1表达明显升高，且加入TGF-β1抑制剂后可明显抑制RhoGDI2诱导的EMT改变。就提示TGFβ1在RhoGDI2诱导EMT过程中起着不可或缺的作用。正常气道上皮细胞可分泌少量的TGF-β1，在特定的条件下(如炎症、损伤)可引起TGF-β1分泌增加，可通过自分泌方式作用于气道上皮细胞自身，与细胞表面的TGF-β1受体结合，进而引起细胞内一系列信号通路诱导EMT过程，并且还正反馈引起TGF-β1表达增多。本研究结果提示TGF-β1在细胞及细胞培养上清液中的蛋白表达量均升高，这与TGF-β1作用方式是符合的。使用特异性的TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂-A3801进行干预，其可抑制激活素受体样激酶的活化，进而阻断TGF-β1引起的生物学效应。但由于TGF-β1可调控细胞内多种信号通路(Smad、非Smad)，具体哪种信号通路参与RhoGDI2诱导的EMT过程尚不清楚，有待进一步研究。